- 齐立,吴昆昱,李梓,张烨,董婕,张立国,张智清
流行性感冒(流感)病毒可引起世界范围的大流行,因此需要及时地生产流感疫苗来预防流感的流行。乙型流感病毒是疫苗的重要组成部分。传统制备疫苗的方法是使用鸡胚生产,存在很多缺陷,应用哺乳动物细胞生产流感疫苗是个更好的选择。但是,乙型流感病毒感染MDCK细胞后,很难得到持续的高产。此实验筛选到的乙型流感病毒在MDCK细胞连续传代15代后,PFU值从第1代的8×104到第15代2×109,TCID50从第1代6 5到第15代的8 0。将筛选到的毒株进行全基因组克隆,用两套引物获得乙型流感病毒的全部8个节段。此结果为利用反向遗传技术将高产毒株与流行毒株重配,进而在哺乳动物细胞上生产基因工程流感疫苗打下基础。
2004年03期 195-199页 [查看摘要][在线阅读][下载 65k] [下载次数:344 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:15 ] |[阅读次数:450 ] - 李晓宇,宋宏,付士红,王环宇,俞永新,董关木,陶三菊,陈端,Ichiro Kurane,梁国栋
为了从分子水平了解中国流行性乙型脑炎(乙脑)病毒与国外分离株的差异,对1949年以来在中国乙脑主要流行地区分离的19株乙脑病毒的PrM C区及E蛋白基因区的核苷酸序列进行了对比研究,以期了解不同时间不同地区在中国流行的乙脑病毒的分子差异。结果显示:病毒生物学初步鉴定显示,病毒感染BHK细胞后56h所有细胞均发生病变,约50%以上细胞脱落(CPE );3日龄乳鼠接种病毒72h之内死亡;所有病毒均与乙脑病毒(A2株)抗血清发生阳性反应,但反应强度不同,提示所有病毒均为乙脑病毒。病毒PrM C(456~695)区核苷酸序列与各个国家及地区、各个基因型以及各个年代的73株乙脑病毒相应序列,用Woan RuChen建立的方法进行基因分型分析,结果显示,所有19株中国分离的病毒均属于基因型Ⅲ型,与国外相关文献所报道的乙型脑炎病毒中国分离株的基因型相符。以乙型脑炎病毒疫苗株P3株为标准,对各病毒E蛋白500个氨基酸序列进行分析。各毒株核苷酸差异在0和4 2%之间,氨基酸差异在0和4 0%之间。所有核苷酸差异均为碱基的替换,无论核苷酸或氨基酸均无插入或丢失。大多数核苷酸变异在氨基酸编码的第三位,属于沉默突变,不引起氨基酸变化。18株病毒E蛋白活性结构域与疫苗株P3株相比共有247个氨基酸的差异,平均每株病毒有12 35个氨基酸的差异,?
2004年03期 200-209页 [查看摘要][在线阅读][下载 331k] [下载次数:1469 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:154 ] |[阅读次数:617 ] - 胡孔新,于建石,孙玉兰,孟祥芝,王晓芳,张全福,李川,梁米芳,李德新
为发展新型疫苗和改造目前使用的麻疹病毒疫苗,以麻疹病毒疫苗株为模板,构建了具有感染性的麻疹病毒cDNA克隆。用RT-PCR分6段扩增出麻疹病毒全长基因,通过酶切、拼接构建麻疹病毒疫苗株CC-47的全长正链cDNA序列,并精确地置于T7启动子控制下与丁型肝炎病毒核酶序列之前。克隆麻疹病毒CC-47株蛋白N、P、L编码区质粒并置于T7启动子控制下,用4个质粒共转染哺乳动物细胞,在表达T7RNA聚合酶的重组痘苗病毒VTF7-3的作用下进行病毒拯救。经免疫荧光、PCR等方法检测证实,获得了具有感染性的麻疹病毒。所拯救的病毒在哺乳动物细胞连续传3代后,仍能检出病毒抗原和核酸。
2004年03期 210-213页 [查看摘要][在线阅读][下载 57k] [下载次数:354 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:12 ] |[阅读次数:414 ] - 余双庆,冯霞,陈国敏,龚非,周玲,曾毅
对HIV 1B亚型gp120基因按照哺乳动物优势密码子的使用原则进行优化,以Westernblot方法比较其体外表达量。将优化前的野生型gp120基因和改造后的modgp120基因插入重组腺伴随病毒载体,构建了重组病毒rAAV wtgp120和rAAV modgp120,比较两者免疫Balb/C小鼠后的抗体和CTL应答。Westernblot检测结果显示:优化后基因的体外表达量明显高于野生型基因,rAAV modgp120与rAAV wtgp120相比可更好地诱导Balb/C小鼠的CTL应答,但检测不到明显的抗体反应。由此得出结论,优化后gp120基因的体外表达量明显高于野生型基因,并且可以诱导更强的特异性CTL应答,但检测不到gp120抗体。
2004年03期 214-217页 [查看摘要][在线阅读][下载 63k] [下载次数:189 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:12 ] |[阅读次数:355 ] - 杨静,姚军,杨宁敏,张毅,伯晓晨,王升启
为筛选乙型肝炎(乙肝)病毒(HBV)感染应答基因,探讨HBV感染分子机理,采用生物信息学分析、筛选宿主细胞中与乙肝病毒、丙型肝炎(丙肝)病毒、流行性感冒(流感)病毒等感染密切相关的基因,设计并合成寡核苷酸探针,制备了含231种病毒感染相关基因的寡核苷酸微阵列。利用此微阵列比较HepG2细胞、HepG2 2 15细胞之间的基因表达谱差异,筛选乙肝病毒感染候选应答基因,从分子水平对乙肝病毒感染作用机理进行初步研究。制备的病毒感染相关基因表达谱微阵列的监测结果显示,阳性对照和看家基因探针出现较强信号,空白点样液和阴性对照探针未出信号,大部分基因探针信号强度在可分析范围内,上矩阵和下矩阵反映的基因表达情况一致,证明微阵列的特异性、敏感性、重复性都较好。HepG2 2 15与HepG2细胞基因表达谱比较结果显示,28个宿主基因在HepG2 2 15细胞中高表达,包括ASGR1、AFP、Fibronectin、APOC等基因;4个基因低表达,包括RRM1、ICSBP等基因。初步筛选获得HBV感染候选应答基因。此结果表明,制备的微阵列敏感性、特异性、重复性好,可为研究病毒宿主相互作用关系提供技术平台,应用此微阵列筛选获得的HBV候选应答基因可为揭示HBV感染的分子致病机理提供新的信息,为抗HBV药物研究提供潜在的作用靶点。
2004年03期 218-224页 [查看摘要][在线阅读][下载 96k] [下载次数:136 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:5 ] |[阅读次数:484 ] - 沈忠英,岑山,滕智平,蔡唯佳,沈健,陈炯玉,陈志坚,李德锐,曾毅
为探明人乳头状瘤病毒(HPV)和促癌剂对食管上皮致癌作用,人胚食管上皮细胞转染HPV协同60钴(60Co)放射观察其恶性转化。用HPV18E6E7AAV转染的人胚食管上皮(SHEE),培养至13代,分为4组,实验组分别用60Co2、4、8Gy照射,每周1次共4周;SHEE未经照射为对照组。细胞形态用相差显微镜观察;细胞DNA合成和定量用3H TdR掺入和用流式细胞仪分析;染色体众数用常规方法分析;致瘤性用软琼脂培养和裸小鼠接种;HPVDNA用PCR检测。经60Co照射后细胞呈凋亡和坏死(危象期)。8周后SHEE4Gy组细胞增殖,增殖指数(34%)和3H TdR摄入增高,软琼脂培养和裸鼠接种出现致瘤性。对照组SHEE组细胞增殖指数24%,伴有少数3H TdR掺入,裸鼠未成瘤。染色体众数:对照组,58~62;4Gy组,63~65;两组HPV18E6E7PCR呈阳性条带。此结果表明,用HPV18E6E7协同60Coγ射线可以使人胚食管上皮恶性转化,60Coγ射线有加速食管上皮细胞恶性转化作用。
2004年03期 225-229页 [查看摘要][在线阅读][下载 90k] [下载次数:122 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:4 ] |[阅读次数:320 ] - 韦莉,刘爵,姚炜光,张方亮,周蛟
测定了我国禽脑脊髓炎病毒(avianencephalomyelitisvirus,AEV)分离株L2Z株的全基因组核苷酸序列。该病毒株的3′和5′非编码区核苷酸序列用3′和5′RACE(cDNA末端快速扩增)法获得。基因组全长为7059个核苷酸残基,包括494个核苷酸残基的5′非编码区、6402个核苷酸残基的开放阅读框和136个核苷酸残基的3′非编码区及poly(A)尾巴。与已发表的AEV疫苗株1143的基因组序列比较发现,它们之间核苷酸和氨基酸的同源性分别为98%和97 6%。结构蛋白(VP1~VP4)中,主要宿主保护性免疫原蛋白VP1氨基酸之间差异较小。与小RNA病毒科其它病毒属相比,在非结构蛋白3D中,预测的8个RNA依赖性RNA聚合酶主要结构域中的4个高度保守。从而进一步确认了AEV的分子特性。
2004年03期 230-236页 [查看摘要][在线阅读][下载 190k] [下载次数:183 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:13 ] |[阅读次数:387 ] - 刘金华,史为民,吴清民,郭玉璞
对1996~2001年间自中国部分养鸡场发病鸡或死亡鸡分离鉴定的8株H9N2亚型禽流感病毒的神经氨酸酶基因(NA),进行了扩增和序列测定,并分析和比较了其核苷酸和氨基酸的同源性。结果表明,NA基因核苷酸和氨基酸同源性分别为97 1%~99 8%和95 7%~99 7%,说明NA基因稳定遗传,高度保守。与A/chicken/HongKong/G9/97相比较,发现中国大陆鸡源H9N2分离株的神经氨酸酶蛋白在其茎部的第63、64、65位点上都有3个氨基酸的丢失,而与中国邻近的韩国、巴基斯坦鸡源H9N2分离株的神经氨酸酶没有氨基酸的丢失,因此这些部位的氨基酸丢失可初步认为是中国大陆H9N2流感病毒分离株的一个标记。系统进化树分析表明,该8株病毒的NA基因属于相同的进化分支,即A/duck/HongKong/Y280/97-like分支,尚未发现NA基因属于A/quail/HongKong/G1/97-like分支的分离株。中国的H9N2分离株与韩国、巴基斯坦等地的H9N2分离株隶属于不同的进化亚分支,说明H9N2亚型禽流感的发生与流行和地域有一定的相关性。
2004年03期 237-241页 [查看摘要][在线阅读][下载 62k] [下载次数:284 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:27 ] |[阅读次数:343 ] - 胡奇林,陈少莺,林锋强,程晓霞,林天龙,江斌,陈仕龙,程由铨,李怡英,朱小丽
从以软脚为主要临床症状,以肝、脾表面有多量灰白色坏死点,肾肿大及出血为主要病变的病番鸭肝、脾组织中分离到5株病毒(MW9710、MW9803、MW9806、MW9809和MW9810)。雏番鸭和雏鹅经人工感染后出现与自然病例相同的临床症状和病理变化,并能回收到病毒。樱桃谷鸭、麻鸭和鸡人工感染不发病。经电镜观察,病毒呈球形,正二十面体,立体对称,无囊膜,有双层衣壳,直径为60nm~73nm,病毒粒子在胞浆中增殖。病毒对乙醚、氯仿、胰蛋白酶、50℃处理1h和3%甲醛处理不敏感。对pH3处理2h、60℃处理30min和紫外线照射敏感。1mol/LMg Cl2不能增强病毒的感染力。病毒核酸型为dsRNA,病毒核酸具有禽呼肠孤病毒的特征:有10条带,按其大小可分为三类:大片段(L1~L3)、中片段(M1~M3)和小片段(S1~S4)。但是MW9710株的M2和S1~S4片段的迁移率明显不同于鸡关节炎病毒(ARV)S1133株,而与番鸭呼肠孤病毒法国株(89330、89026株)的核酸电泳图谱极为相似。在血清中和试验中,ARVS1133和MW9710株互不交叉。并且,以针对ARVS1基因的特异性引物XZ11、XZ12对MW9710株等进行RT PCR扩增,只能从ARV中扩增出特异性条带;而以MDRV89026株S1基因的特异引物HP11、HP12进行RT PCR扩增,只能从MW9710等分离毒株中扩增出特异性条带。上述结果表明,MW9710株等5
2004年03期 242-248页 [查看摘要][在线阅读][下载 93k] [下载次数:797 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:161 ] |[阅读次数:351 ] - 方六荣,肖少波,江云波,牛传双,张辉,陈焕春
以伪狂犬病毒基因缺失标志疫苗株TK-/gG-/LacZ+为亲本株,通过同源重组,构建了表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)主要免疫原性蛋白GP5的重组伪狂犬病毒TK-/gG-/GP5+。经PCR、Southern杂交、Westernblot证实构建正确,并能表达GP5。同时,对重组病毒在PK-15细胞中的增殖特性进行了检测,结果与亲本株相比,增殖滴度无显著性差异。将重组病毒免疫BALB/c小鼠,2次免疫后4周,50%(3/6)小鼠产生了低水平的GP5特异性ELISA抗体,但中和抗体均小于1:4。
2004年03期 249-254页 [查看摘要][在线阅读][下载 96k] [下载次数:779 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:84 ] |[阅读次数:408 ] - 曾勇,陆承平
通过抑制性差减杂交技术建立了包含对虾白斑综合征病毒表达性基因的差减文库,并用cDNA微阵列技术进行了鉴定,得到255个正向克隆。对其中的184个正向阳性克隆进行了测序,测序结果通过BLAST与GenBank中序列进行比对,共得到WSSV(whitespotsyndromevirus,WSSV)基因30个。此次首次鉴定了5个,其中WSV184具有调控蛋白的结构特征(Cys2/Cys2型锌指),WSV321和WSV322含跨膜结构,且存在可能的糖基化位点。有3个被其它研究推断无polyA结构的阅读框所处的mRNA应有polyA结构。进一步用DotNorthernblot对克隆号PCI118(含WSSV阅读框WSV321和WSV322)进行鉴定,表明确实存在该基因的转录。进而根据已报道的WSSV基因序列设计两条引物,用快速扩增cDNA末端技术,扩增WSV321和WSV322两个阅读框所处的cD NA的5′端片段和3′端片段,分析得到其全长共1109bp,与已报道的WSSV全基因序列(AF332093)的相关序列完全相同。该mRNA存在polyA,并有加尾信号AATAAA;两个阅读框都没有自己的TATA盒,但都有病毒RNA聚合酶Ⅱ的结合位点-CCAAT盒;它们编码的蛋白质分别有117和227个氨基酸,都存在可能的糖基化位点,其中WSV321一个,WSV322两个。
2004年03期 255-260页 [查看摘要][在线阅读][下载 144k] [下载次数:192 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:7 ] |[阅读次数:326 ] - 魏国庆,林茂芳,黄河,蔡真2004年03期 261-265页 [查看摘要][在线阅读][下载 133k] [下载次数:116 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:2 ] |[阅读次数:307 ]
- 李平川,张晓光,周玲,曾毅2004年03期 266-269页 [查看摘要][在线阅读][下载 58k] [下载次数:136 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:5 ] |[阅读次数:327 ]
- 高志强,郭鑫,陈艳红,查振林,杨汉春2004年03期 270-274页 [查看摘要][在线阅读][下载 107k] [下载次数:277 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:27 ] |[阅读次数:365 ]
- 闫芳,夏咸柱,李德生,王鹏彦,高凤山,高玉伟,黄耕2004年03期 275-278页 [查看摘要][在线阅读][下载 59k] [下载次数:250 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:16 ] |[阅读次数:390 ]
- 许光治,张志芳,覃光星,黄可威,郭锡杰2004年03期 279-282页 [查看摘要][在线阅读][下载 78k] [下载次数:154 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:9 ] |[阅读次数:329 ]
- 尹志华,姚开泰2004年03期 283-287页 [查看摘要][在线阅读][下载 85k] [下载次数:232 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:4 ] |[阅读次数:343 ]
- 徐芳玲,杨占秋2004年03期 288-290页 [查看摘要][在线阅读][下载 41k] [下载次数:158 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:4 ] |[阅读次数:389 ]
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