- 李启明,马学军,侯云德
滚环复制是噬菌体繁殖所采取的一种基因复制方式,这种方式可使单链的环形分子在聚合酶和引物的作用下进行体外自我扩增。本文中用可特异性连接环化的寡核苷酸链作为探针,分别进行了1份细胞培养的禽流感病毒H5N1亚型样品、1份细胞培养的SARS病毒样品和4份丙型肝炎病毒阳性血清样品的检测。检测原理是探针与靶序列杂交后便可在T4DNA连接酶的作用下形成滚环复制中的环化单链分子,该分子在同温下可被特异性引物滚动复制和支链扩增。本文还利用按禽流感病毒NA1基因区序列合成的模拟DNA分子对该检测方法的灵敏度进行了测试。结果显示:利用固相RCA技术成功检测到三种RNA病毒的基因,该方法的灵敏度可达到能检测103拷贝模式DNA分子的水平。与传统的PCR方法敏感性的比较尚待进一步研究。
2005年04期 243-247页 [查看摘要][在线阅读][下载 71k] [下载次数:509 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:9 ] |[阅读次数:403 ] - 朱俊萍,孙立连,卫灿东,李琳琳,金奇
以肠道病毒71型及其宿主细胞为研究主体,建立了一种二维液相色谱分离和分析比较病毒感染前后细胞蛋白表达谱的方法。该方法以高效液相色谱(HPLC)为技术平台,对细胞裂解物先后进行一维色谱聚焦分离和二维反相色谱分离。利用ProteoVue软件将二维色谱数据转换成模拟胶图,再利用DeltaVue软件对感染前后的宿主蛋白表达谱进行比较和分析,找出差异蛋白。二维液相色谱分离法能够根据蛋白的等电点和疏水性建立精确的细胞蛋白表达图谱,每0.2个pH为一个收集区段,在pH8.5~3.9的范围内可见蛋白条带约1200条。该方法良好的重现性、自动化以及结果分析的简易化,使之在细胞表达谱差异显示中的应用潜力巨大,并且为研究病毒与宿主相互作用提供了新的方法和思路。
2005年04期 248-252页 [查看摘要][在线阅读][下载 93k] [下载次数:296 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:9 ] |[阅读次数:353 ] - 徐丽宏,梁国栋,付士红,曹玉玺,关坤萍,夏国良,吴士俊,张智清
为了研究乙型肝炎(乙肝)病毒表面抗原(HBsAg)发生G145R突变后的免疫学特性改变情况,首先利用Pichiapastoris酵母表达系统分泌表达G145R突变后的HBsAg的preS2+S(中蛋白),用重组表达产物免疫小鼠,酶联免疫吸附试验(ELISA)和Westernblot实验等研究其抗原性和免疫原性与野毒型HBsAg的异同。从150个阳性表达克隆中筛选出一株表达量最高的克隆株MC23,Westernblot检测显示,表达的HBsAg中蛋白单体主带分子量在34kD、37kD左右,表达量约为200μg/L。用不同的HBsAg检测试剂检测其抗原性发现,G145R突变后的HB-sAg,用绝大多数试剂都不能很好地检出,检出能力只有野毒型HBsAg的50%或更低,但用美国雅培公司的试剂检出能力可达野毒的98%。G145R突变后的HBsAg中蛋白免疫小鼠后,血清中可检测到1∶1600的特异性表面抗体,该抗体与G145R突变后的HBsAg“a”决定簇合成肽P2-145R也能发生交叉反应,反应滴度为1∶80。但该抗体和野毒型HBsAg蛋白以及野毒“a”决定簇合成肽P1-wt均不反应。上述结果表明,G145R突变后的HBsAg中蛋白在Pichiapastoris酵母系统得到了分泌表达,表达产物仍具有较好的免疫原性,但和野毒HBsAg相比,其抗原性和免疫原性发生了明显改变。
2005年04期 253-258页 [查看摘要][在线阅读][下载 82k] [下载次数:90 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:1 ] |[阅读次数:407 ] - 王彦斌,常昭瑞,魏海燕,晁彦公,曲成毅,王健伟,洪涛
为了确定特异的SARS抗体检测抗原,比较了SARS冠状病毒(SARS-CoV)主要结构蛋白与SARS患者血清的反应性。从SARS死亡患者的肺组织提取的总RNA为模板,用RT-PCR技术分别扩增S、N、M和E4种结构蛋白基因,对3种S截短突变体和N、M、E的重组蛋白在大肠杆菌中进行表达。以表达的蛋白为抗原,应用Westernblot跟踪检测11例SARS患者血清54份。结果显示:SARS-CoV的重组N蛋白和S蛋白有很强的抗原性,S蛋白的3个区段的抗原性强弱存在差异,S3抗原性强于S1和S2;在患病第1周、2周、3周及3周以上,N蛋白和S3蛋白抗体检出率分别为40%、65.2%、100%、100%和40%、61%、76.2%、100%;提示SARS-CoV重组N蛋白和S3蛋白在SARS的血清学诊断中有一定的应用价值。
2005年04期 259-263页 [查看摘要][在线阅读][下载 70k] [下载次数:114 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:6 ] |[阅读次数:366 ] - 张瑾,王小凡,高建梅,李锋,韩俊,陈岚,张宝云,周伟,刘勇,董小平
PrP细胞外构象转化系统已经被一些实验室用于朊病毒的研究,但在反应体系中往往需要使用放射性同位素。为了建立一种安全方便的PrP无细胞构象转化系统用于TSE发病机制的研究,通过PCR方法获得仓鼠PrP(HaPrP)全长基因,克隆至原核表达载体pQE30,在大肠杆菌中表达并纯化出分子量为27kDHaPrP蛋白,Westernblot证实可与PrP特异性单克隆抗体反应。将纯化蛋白在体外标记生物素(Biotin-7-NHS),与纯化的scrapie263K毒株仓鼠感染脑组织PrPSc蛋白共同孵育4天后,经蛋白酶K消化,Westernblot检测,证明存在一条抵抗蛋白酶K消化的、被亲和素特异性识别的条带,其分子量约为20kD。这表明HaPrPsen可以被转化为HaPrPres。实验表明,可以利用原核系统取代真核系统表达PrP,并用生物素标记取代35S标记纯化蛋白,建立一个更加安全方便的无细胞构象转化系统,用于朊病毒的研究。
2005年04期 264-268页 [查看摘要][在线阅读][下载 68k] [下载次数:113 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:0 ] |[阅读次数:454 ] - 吴玉萍,陈裕隆,李隆玉,梁增文,张雁玲
本文探讨了江西省和广东省宫颈癌患者人乳头瘤病毒(Humanpapillomavirus,HPV)感染及其型别分布,分析了高危型HPV对各种宫颈病变的感染情况,为宫颈癌的早期发现和临床诊治提供科学依据。首先采用细胞学、HPVDNA检测(第二代杂交捕获法,HC2)、电子阴道镜和宫颈化学着色方法筛查宫颈癌患者,经病理镜检确诊,然后用GPPCR-SBT法对宫颈癌患者进行HPV基因分型。江西省溪口镇、古市镇及修水县城宫颈癌癌前病变发生率为5.7‰。HC2方法发现宫颈癌患者13种高危型HPVDNA阳性率为89.9%,宫颈上皮内瘤样病变的为84.8%,对照组为24.5%。采用GPPCR-SBT方法进行基因分型发现,江西省宫颈癌患者存在HPV16、58、31、33、18、66、6、11、56和81十种型别,其中HPV81型在国内外鲜有报道。据此提出生殖道高危型HPV感染是妇女宫颈癌发病的重要因素,并发现江西省宫颈癌高发区妇女高危型HPV感染率为24.5%。建立了HPV基因分型的方法,对HPV致宫颈病变的分子机制进行了分析。
2005年04期 269-273页 [查看摘要][在线阅读][下载 56k] [下载次数:2639 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:76 ] |[阅读次数:1003 ] - 任桂杰,王志玉,王桂亭,宋艳艳,许洪芝,温红玲
为了解融合蛋白F1分子的胞外非保守区在融合蛋白(F)与血凝素-神经氨酸酶(HN)的特异性膜融合中的作用,采用基因定点突变方法,在新城疫病毒(NDV)F1与人副流感病毒(hPIV)F1基因的胞外非保守区进行定点突变,创造酶切位点,得到分别含3个相同酶切位点的突变株NDV-M和hPIV-M。经检测,突变体的细胞融合功能与野毒株相同。然后用3个限制性内切酶分别从NDV-M与hPIV-M中切出两个片段NDVF-1、F-2及hPIVF-1、F-2。NDV-M和hPIV-M相互交换对应的F-1片段后进行基因重组,得到2个嵌合体(Chimera),即NDV-C1和hPIV-C1;同样方法交换F-2片段后又得到2个嵌合体NDV-C2和hPIV-C2。将各种嵌合体DNA与同源及异源HN基因共转染BHK21细胞后,在真核细胞中表达。Giemsa染色和指示基因法检测细胞融合功能,荧光强度分析(FACS)检测F蛋白的表达效率。结果表明,突变体NDV-M和hPIV-M的细胞融合功能与野毒株相同,可用于构建嵌合体。NDV-C1和NDV-C2分别与NDVHN共表达后,融合功能达到野毒株的76.34%和96.2%,与hPIVHN共表达后均无细胞融合发生;hPIV-C1和hPIV-C2分别与hPIVHN共表达后,融合功能达到野毒株的65.82%和93.78%,与NDVHN共表达后无细胞融合发生。FACS分析表明,突变体及所有嵌合体蛋白F的表达效率与野毒株相比均没有明显变化。实验结果说明在F1蛋白的胞外非保守区中,NDVF-1和hPIVF-1这两个片段对于NDV和hPIV的特异性膜融合具有重要作用;而NDVF-2和hPIVF-2这两个片段对于NDV和hPIV的膜融合来讲,则特异性较低。
2005年04期 274-278页 [查看摘要][在线阅读][下载 77k] [下载次数:152 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:6 ] |[阅读次数:380 ] - 于建石,孟祥芝,胡孔新,刘琴芝,张全福,李川,李德新
用RT-PCR方法分段扩增了乙型脑炎病毒SA14-14-2疫苗株5′、3′NCR,利用融合PCR技术在5′、3′NCR之间引入BamHⅠ酶切位点,将5′NCR置于T7启动子控制之下,构建乙脑病毒微复制子表达载体pMR。分别将绿色荧光蛋白(GFP)和汉滩病毒核蛋白编码区基因插入到pMR中,构建两种表达外源基因的乙脑病毒微复制子表达载体:pMR-GFP和pMR-84FliS。经荧光显微镜直接观察、Westernblot、ELISA等方法检测,证实外源基因能够在辅助病毒SA14-14-2感染的BHK-21细胞中表达。
2005年04期 279-283页 [查看摘要][在线阅读][下载 84k] [下载次数:198 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:2 ] |[阅读次数:327 ] - 陈素娟,石火英,孙蕾,刘秀梵
为了构建更为安全有效能同时抵抗高致病性H5亚型和低致病性H9亚型禽流行性感冒(禽流感)病毒的基因工程疫苗,将H5和H9亚型禽流感病毒分离株的血凝素(HA)基因,分别由鸡痘病毒早晚期启动子PS和PE/L调控其转录,定向插入鸡痘病毒转移载体p11S中,获得H5A和H9A基因分别处于PS及PE/L启动子转录调控下的重组转移载体p11SH5H9。以FuGeneTM6转染法将p11SH5H9转染至已感染鸡痘病毒282E4疫苗株(wt-FPV)的鸡胚成纤维细胞(CEF)中。p11SH5H9与wt-FPV基因组DNA之间的同源重组产生了重组鸡痘病毒rFPV-11SH5H9。通过在含X-gal的营养琼脂上连续挑选蓝色病毒蚀斑获得并纯化rFPV-11SH5H9。以间接免疫荧光法试验证实,纯化的rFPV-11SH5H9感染的CEF能同时表达H5A和H9A。初步的动物试验表明,用105PFU的rF-PV-11SH5H9免疫无特定病原体(SPF)鸡,免疫后血凝抑制(HI)抗体监测阳性率均为100%(8/8);该重组病毒能显著抑制H9亚型AIV滴鼻、点眼后7日龄SPF鸡从气管和泄殖腔排毒,同时也能抵抗H5亚型AIV肌肉注射后对7日龄SPF鸡致死性攻击,保护率均为100%,显示出一定的应用前景。
2005年04期 284-288页 [查看摘要][在线阅读][下载 80k] [下载次数:246 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:18 ] |[阅读次数:370 ] - 徐镔蕊,董卫星,余春明,Lucy F.Lee
根据J亚群白血病病毒(ALV-J)原型株HPRS-103的序列设计了一对针对外源性ALV-J引物H5和H7,从发生ML病死鸡的肿瘤、骨髓、肝脏、脾脏和输卵管组织中提取DNA作为模板,经PCR扩增得到长度为545bp的片段,对其序列进行测定后,与ALV-J原型株HPRS-103的序列进行了比较,发现其核苷酸同源性为97.4%,所编码氨基酸的同源性为96.1%。该片段含有ALV-Jgp85编码基因的部分序列和ALV-Jpol基因的部分序列,从分子水平上证实了蛋鸡发生J亚群禽白血病,进一步证明了此前根据病理学观察、免疫组化及免疫荧光诊断的结果。这是首次从分子水平上证明蛋用型鸡发生J亚群禽白血病。
2005年04期 289-292页 [查看摘要][在线阅读][下载 89k] [下载次数:554 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:114 ] |[阅读次数:293 ] - 韩静,陈晨,曹红,陈福勇
将禽白血病病毒(ALV)的p27基因克隆入表达性载体pET28a,在大肠杆菌以HisTag融合蛋白的形式获得了高效表达。以表达产物免疫家兔,制备了抗ALVp27的多克隆抗体,经亲和纯化后,用此抗体建立了对ALV抗原的双抗体夹心法ELISA,并对疑似病料进行了实验室诊断。检测结果与IDEXX的禽白血病抗原检测试剂盒符合率达到98.6%,证明表达产物保留了天然p27蛋白的相关抗原性。交叉试验和群特异性试验证明,此方法具有良好的特异性,并且可以检测出A、BJ、亚群的禽白血病病毒p27抗原。用此ALV抗体和所建立的ELISA方法成功地进行了禽白血病病毒抗原的实验室诊断。
2005年04期 293-297页 [查看摘要][在线阅读][下载 61k] [下载次数:317 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:30 ] |[阅读次数:315 ] - 马铮,李巧丽,宋任涛,许政暟
对野生型烟草花叶病毒(TMV-U1)的外壳蛋白羧端序列进行系列缺失突变,观察到TMV-U1株系的外壳蛋白羧端序列缺失6个氨基酸(保留152个氨基酸),仍能较强系统侵染烟草并高水平表达外壳蛋白,且能在新生叶里复制大量完整的病毒粒子。该研究结果表明:外壳蛋白羧端6个氨基酸序列并非烟草花叶病毒感染和复制所必需,并对利用外壳蛋白羧端缺失型病毒载体表达外源多肽具有一定的启示性。
2005年04期 298-302页 [查看摘要][在线阅读][下载 81k] [下载次数:170 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:2 ] |[阅读次数:350 ] - 李志杰,要国华,刘靖华,赵善超,邓鹏,徐军,姜勇2005年04期 303-304页 [查看摘要][在线阅读][下载 32k] [下载次数:230 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:4 ] |[阅读次数:291 ]
- 刘文强,杨少华,栾婧婧,高运东,仲跻峰,赵宏坤2005年04期 305-307页 [查看摘要][在线阅读][下载 40k] [下载次数:143 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:13 ] |[阅读次数:298 ]
- 青玲,周雪平2005年04期 308-310页 [查看摘要][在线阅读][下载 39k] [下载次数:162 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:10 ] |[阅读次数:304 ]
- 吴元华,朱春玉,杜春梅,王艳红,赵秀香2005年04期 311-313页 [查看摘要][在线阅读][下载 32k] [下载次数:183 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:40 ] |[阅读次数:300 ]
- 高永珍,金奇2005年04期 314-317页 [查看摘要][在线阅读][下载 59k] [下载次数:414 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:14 ] |[阅读次数:377 ]
- 范树国,林纳生2005年04期 318-323页 [查看摘要][在线阅读][下载 92k] [下载次数:143 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:0 ] |[阅读次数:390 ]
- 2005年04期 325页 [查看摘要][在线阅读][下载 256K] [下载次数:55 ] |[网刊下载次数:42 ] |[引用频次:0 ] |[阅读次数:142 ]
下载本期数据