- 聂凯;王大燕;秦萌;高荣保;王淼;邹淑梅;韩峰;赵翔;李希妍;舒跃龙;马学军;
建立了一种基于颜色判定的简单、快速和灵敏的检测方法,即环介导逆转录等温核酸扩增技术(RT-LAMP)应用于人甲型H1N1流感病毒基因检测。该技术使用对应于人甲型H1N1流感病毒HA序列中8个基因区段的6条特异引物,在等温条件下(65℃)进行核酸扩增反应1.5h,在扩增前加入染料HNB(羟基萘酚蓝)作为反应指示剂,以HNB的颜色变化做为结果判定标准并经琼脂糖凝胶电泳验证。文中利用这种技术对不同来源及亚型的流感病毒进行了特异性分析,对体外转录的人甲型H1N1流感病毒HA基因RNA的系列稀释物进行了灵敏度分析,成功检测美国CDC提供的人甲型H1N1流感病毒标准品,利用RT-LAMP和RT-PCR同时检测了30份人甲型H1N1和26份季节性流感咽拭子标本。结果显示RT-LAMP方法特异性高,灵敏度可达到60个拷贝RNA分子水平,对临床标本的检出率与常规RT-PCR法相当,利用650nm的比色分析通过标准曲线可以实现对样品的定量。因此,基于颜色判定的环介导逆转录等温扩增方法可用于人甲型H1N1流感病毒感染的快速筛选,具有在基层疾病预防控制中心流感监测网络实验室和哨点医院推广和应用的潜力。
2010年02期 v.26 81-87页 [查看摘要][在线阅读][下载 412K] [下载次数：745 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：53 ] |[阅读次数：478 ] - 赵丽;刘永宏;刘月焕;王凤龙;林健;韩春华;马明;丁玉林;丁旭娜;王金玲;杨龙峰;潘洁;韩婧雯;
为了分析2009年新型A型H1N1流感病毒分子流行病学的特点,本文从NCBI上下载不同分离宿主的流感毒株各节段全基因序列应用分子生物学软件进行遗传演化分析,结果显示:新型A(H1N1)流感毒株与过去的人源A(H1N1)毒株相比差异较大,相对于此前的人源A(H1N1)流感毒株,HA出现了79个位点发生突变。其中14个是相对于所有来源A(H1N1)流感毒株的新突变位点,但有37个突变位点只能在猪源毒株中找到。究竟这一现象说明新型A(H1N1)流感毒株是猪、人源毒株的重组变异毒株,还是猪源H1N1感染人群后逐渐变异并适应人群的结果,还有待进一步研究。
2010年02期 v.26 88-96页 [查看摘要][在线阅读][下载 750K] [下载次数：439 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：5 ] |[阅读次数：355 ] - 秦萌;王大燕;黄芳;聂凯;曲梅;王淼;韩峰;赵翔;成艳辉;舒跃龙;马学军;
本研究设计的一种4重荧光定量RT-PCR检测方法,以A型流感病毒各亚型的血凝素基因(HA)为检测靶标,实现了同时检测新甲型H1N1流感病毒、人季节性H1N1流感病毒和人季节性H3N2流感病毒。本法使用人细胞RNA酶P基因作为内参,以判断标本来源和实施质量控制。利用不同来源和亚型的流感病毒验证了该方法的特异性;利用连续稀释的新甲型H1N1流感病毒HA全基因体外转录物进行灵敏度分析。结果表明该方法灵敏度高,可检测低至20个拷贝的RNA;特异性强,每对引物只检测出对应的病毒,无交叉反应;并且成功地验证性检验了34份新甲型H1N1流感病毒阳性临床标本和20份人季节性H1N1和H3N2流感病毒及人乙型(HB)流感病毒阳性临床标本。因此,该多重荧光定量RT-PCR法是一种可同时检测2009年新甲型流感病毒及季节性流感病毒的有效方法。
2010年02期 v.26 97-102页 [查看摘要][在线阅读][下载 346K] [下载次数：880 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：15 ] |[阅读次数：377 ] - 王慧玲;郑蕾;王骥涛;郜慧;张燕;孔晓慧;许文波;
本文报道了2009年中国首例输入性D4基因型麻疹病例。使用Vero/SLAM细胞(淋巴信号激活因子转染的非洲绿猴肾细胞)对该麻疹病例的咽拭子标本进行麻疹病毒分离,经逆转录聚合酶链反应(Reverse transcript polymerase chain reaction,RT-PCR)方法扩增出麻疹病毒核蛋白(Nucleoprotein,N)羧基(COOH)端676个核苷酸片段。通过对扩增产物进行核苷酸序列测定和分析,以COOH端450个核苷酸片段构建基因亲缘性关系树,进行核苷酸和氨基酸同源性分析。该麻疹病毒分离株(MVi/Shanxi.CHN/20.09/1)和WHOD4基因型参考株Mont-real.CAN/89在基因亲缘性关系树上同属一个分支,核苷酸同源性为97.3%;与2009年流行于美国、加拿大、印度和俄罗斯的D4基因型麻疹野病毒的核苷酸和氨基酸同源性分别为98.0%～100%和97.3%～100%。结果表明,在本次输入性麻疹病例中分离到的麻疹病毒属于D4基因型,这对积累我国麻疹分子流行病学基线数据具有很重要的意义,同时也有助于监测和阐明麻疹病毒的传播途径。
2010年02期 v.26 103-108页 [查看摘要][在线阅读][下载 442K] [下载次数：217 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：61 ] |[阅读次数：375 ] - 余蓓蓓;冯燕;徐昌平;卢亦愚;钱景;
由于从临床症状上难以区分麻疹病毒或风疹病毒引起的人群急性发热出疹性传染病,故而分别设计针对麻疹病毒和风疹病毒的特异性引物和荧光标记探针,建立含内质控的多重荧光RT-PCR以同时检测麻疹病毒和风疹病毒的核酸。结果表明:建立的多重荧光RT-PCR方法特异性好,试验验证没有出现假阳性和假阴性现象;该方法的灵敏度高,对麻疹病毒和风疹病毒的最低检出限分别达到0.1TCID50/mL和1TCID50/mL,可从疑似患者咽拭子等标本中直接检测到病毒核酸;同时该方法具有良好的稳定性,当分别用0.1～103TCID50/mL麻疹和风疹病毒的样本进行重复试验时,其CT值变异系数均在0.9%以下。此外,以人核糖核酸酶P(RNaseP)作为内质控,可以有效监控临床标本的采样质量及因操作失误等所致的假阴性结果出现。本方法尤其适用于疑似麻疹或风疹暴发疫情的临床快速诊断。
2010年02期 v.26 109-114页 [查看摘要][在线阅读][下载 653K] [下载次数：346 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：9 ] |[阅读次数：307 ] - 余双庆;冯霞;刘红梅;杨海儒;李红霞;曾毅;
本文旨在研究表达HIV-1中国流行株gp120基因的重组腺相关病毒疫苗在小鼠和恒河猴体内的免疫原性。用rAAV2/1-gp120免疫BALB/c小鼠和恒河猴,分别用ELISA和HIV-1假病毒中和试验检测免疫动物血清中HIV-1特异性IgG抗体水平和中和抗体水平,用ELISPOT方法和体内杀伤实验检测HIV-1特异性细胞免疫应答水平。结果显示在小鼠体内用rAAV2/1-gp120仅免疫一次就能诱导较高水平的IgG抗体,IgG抗体至少能持续21周,但没有检测到中和抗体。rAAV2/1-gp120在小鼠体内诱导微弱水平的HIV-1特异性细胞免疫应答。rAAV2/1-gp120在恒河猴体内诱导的HIV-1特异性细胞和抗体反应均很弱,且检测不到中和抗体。提示rAAV2/1载体在诱导抗体反应方面具有特殊优势,但若希望诱导HIV-1特异性中和抗体,则需要改造env基因以提高其免疫原性。
2010年02期 v.26 115-120页 [查看摘要][在线阅读][下载 355K] [下载次数：249 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：6 ] |[阅读次数：368 ] - 唐丽;朱武洋;付士红;何英;王志玉;梁国栋;
为观察nsP2-726Pro定点诱变对辛德毕斯病毒(Sindbis virus,SINV)XJ-160复制子载体特性的影响,以XJ-160病毒复制子载体pBRepXJ为分子基础,利用定点诱变方法分别构建突变载体pBRep-726L、pBRep-726S、pBRep-726V和pBRep-726A。将新霉素抗性基因(Neomycinr,Neor)克隆到pBRepXJ和各突变载体中,通过细胞培养方法观察nsP2-726Pro定点诱变对载体致细胞病变作用(Cytopathic effect,CPE)的影响;并将增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green-fluorescent protein,EGFP)和海肾萤光素酶(Renilla Luciferase,R.luc)报告基因分别插入到各载体中,定性与定量检测定点诱变对复制子载体自主复制能力的影响。实验结果表明,突变载体pBRep-726V和pBRep-726A在BHK-21细胞中的自主复制能力高于pBRepXJ,所诱发的细胞病变进程更快。替换突变nsP2-726Pro→Leu的引入使载体在保持包装能力的同时,完全丧失在细胞上引起CPE的能力。而pBRep-726S则具有中间表型。提示nsP2-726Pro定点诱变在影响XJ-160复制子载体自主复制能力的同时,也改变了CPE的进程。这将为研究辛德毕斯病毒基因组结构与功能的关系及构建非细胞病变的甲病毒载体奠定基础。
2010年02期 v.26 121-127页 [查看摘要][在线阅读][下载 866K] [下载次数：122 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：355 ] - 曹学智;林跃智;李利;姜成刚;赵立平;吕晓玲;周建华;
慢病毒免疫应答的载量阈值学说认为病毒载量决定了机体对病毒反应的类型。为了探讨马传染性贫血病毒(EIAV)血浆病毒载量与马体免疫保护的相关性,本研究利用Real-time RT-PCR方法对EIAV弱毒疫苗株(EIA-VDLV125)免疫马和EIAV强毒株(EIAVLN40)非致死剂量接种马血浆中病毒载量进行了动态比较。结果显示两组马在监测过程中皆可检测到相似水平的病毒载量(103～105copies/mL),且两者之间差异不显著(P>0.05)。以上毒株接种23周后,对马匹进行了强毒株(EIAVLN40)的致死剂量攻毒,根据攻毒后典型马传贫急性发病与否确定接种保护率。结果显示,疫苗组的保护率为67%而非致死剂量强毒组的保护率为0。以上结果提示,病毒血浆载量不是决定EIAV弱毒疫苗诱导免疫保护能力的主要或单一因素。
2010年02期 v.26 128-133页 [查看摘要][在线阅读][下载 708K] [下载次数：164 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：3 ] |[阅读次数：324 ] - 施开创;屈素洁;陈进喜;许瑞胜;郑敏;刘棋;陈汉忠;李刚;
对猪源脑心肌炎病毒(EMCV)GXLC株进行全基因组克隆、测序和分析。采用RT-PCR技术分段扩增基因组可读框(ORF),应用3'-RACE和5'-RACE技术扩增3'-UTR和5'-UTR,分别对扩增片段进行克隆和测序,经拼接后获得GXLC株全基因组序列,共7725个核苷酸。与NCBI GenBank登录的国内外参考毒株进行同源性比较及系统进化分析结果表明,GXLC株与GX0601、GX0602、BJC3、HB1等国内分离株以及CBNU、K3、K11、BEL-2887A、EMCV-R、PV21等国外分离株同源性达99%以上;基于全基因组、结构蛋白及非结构蛋白基因序列绘制的系统进化树拓扑结构图相近,所有EMCV分离株可分成两个群:I群和II群,I群可细分为Ia亚群和Ib亚群,其中猪源EMCV属于Ia或Ib亚群、鼠源EMCV属于Ia亚群、野猪源EMCV属于II群,GXLC株与其它中国分离株均属于Ia亚群。
2010年02期 v.26 134-142页 [查看摘要][在线阅读][下载 604K] [下载次数：310 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：23 ] |[阅读次数：403 ] - 蔡铭升;程安春;汪铭书;朱德康;罗启慧;招丽婵;贾仁勇;刘菲;陈孝跃;
根据本实验室获得的鸭瘟病毒(DPV)UL35基因序列(GenBank登录号:EF643558),利用Oligo6.0和Prim-er5.0软件设计一对引物,PCR扩增出DPV CHv强毒株UL35基因,随后将其克隆至pMD18-T构建克隆质粒pMD18-T-UL35,经PCR和酶切鉴定后亚克隆至大肠杆菌原核表达载体pET-32a(+),获得表达质粒pET-32a(+)-UL35后将其转化至大肠杆菌BL21(DE3),经1.0mmol/L的IPTG在34℃诱导5h获得最佳表达。SDS-PAGE分析表明UL35基因表达的重组蛋白(VP26)分子量约为33kD,薄层扫描分析结果显示VP26占菌体总蛋白的32.3%,主要以包涵体的形式存在。经Ni+-NTA琼脂糖凝胶亲和层析纯化后免疫家兔制备抗VP26重组蛋白血清,血清琼脂扩散试验抗体滴度检测结果达1:32。用High-Q阴离子交换层析纯化抗血清获得兔抗VP26重组蛋白IgG,经Western blot检测显示抗血清可与VP26发生特异性反应。通过免疫荧光技术进行DPVVP26亚细胞定位检测,结果表明DPV感染DEF后2～8h细胞核内荧光的量相对较少,12～36h逐渐增加,48～72h达到最多,并且在细胞核内的斑点区域聚集呈颗粒状分布;而在细胞质内12h才开始出现少量荧光,荧光量在DPV感染后24～48h期间随感染时间延长而增加,在感染后72h最多。以上结果为阐明和进一步开展DPVUL35基因的功能研究提供了重要数据和材料。
2010年02期 v.26 143-149页 [查看摘要][在线阅读][下载 492K] [下载次数：250 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：6 ] |[阅读次数：378 ]