• 两例丙型肝炎病毒(HCV)和乙型肝炎病毒(HBV)重叠感染者的HCV核心区cDNA序列分析

    王海林,夏宁邵,洪宁,胡黎明,郑延硕,刘敏,金冬雁,毕胜利,侯云德

    从临床肝病患者中选择两例HCV和HBV重叠感染者HSQ和SZH,他们血清中的生化指标丙氨酸转氨酶(ALT)持续异常,肝活检病理示有严重的肝损伤。在ALT异常期,血清学检测结果为HBsAg、HBeAg阳性,抗HCVIgG(包括C22、C33c)阴性,但套式PCR检测HCVRNA阳性,核心区cDNA序列分析发现该区有1个密码子(GGCnt385—387)缺失,对应缺失的氨基酸是甘氨酸(GLY),从血清学检测和序列分析结果推测,在HCV和HBV重叠感染中,HBV和HCV均可处于持续复制状态,抗HCVIgG抗体阴性可能是HCV的多蛋白前体翻译和病毒颗粒装配受到HBV干扰的结果。

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  • 应用反转录聚合酶链式反应快速检测蕃茄环斑病毒

    陈京,胡伟贞,于嘉林,韩成贵

    应用反转录聚合酶链式反应快速检测蕃茄环斑病毒陈京,胡伟贞,于嘉林,韩成贵关键词反转录聚合酶链式反应,蕃茄环斑病毒近年来发展起来的分子生物学新技术一聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction,PCR)已在检测和分子生物学研究等许多领...

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  • 杆状病毒早期基因启动子载体的构建及报道基因的表达

    朱反修,黄永秀,齐义鹏,胡建红

    以AcNPVp10基因为侧翼序列,用AcNPV的IE1基因启动子构建了杆状病毒早期基因启动子载体,并将新霉素抗性基因(neo)插入IE1基因启动子下游,得到转移载体pAcPIneo。将它和野生型AcNPVDNA共转染昆虫细胞Sf9,由于neo基因的表达,通过G418的选择和富集作用,得到重组病毒vAcPIneo的纯培养。用酶切和Southern印迹杂交证明,neo基因整合于AcNPV基因组的p10基因位相。用重组病毒感染昆虫细胞,不同时间取样提取RNA并进行杂交,结果表明neo基因在受染细胞内从早期到晚期都可发生转录。

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  • 从我国肝炎患者中检出GBV一C型肝炎病毒RNA

    王海林,夏宁邵,谭文杰,詹美云,苏文金,侯云德

    从我国肝炎患者中检出GBV一C型肝炎病毒RNA王海林,夏宁邵,谭文杰,詹美云,苏文金,侯云德(中国预防医学科学院病毒研究所,北京100052)关键词GB一C型肝炎病毒,逆转录多聚酶链式反应在我国病毒性肝炎病人中,约有10%的病人为非甲一戊型肝炎,这些...

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  • 在昆虫细胞中表达Epstein一Barr病毒膜蛋白

    谷淑燕,刘展,周为民,韩春卉

    在昆虫细胞中表达Epstein一Barr病毒膜蛋白谷淑燕,刘展,周为民,韩春卉H,Wolf(中国预防医学科学院病毒学研究所,北京100052)关键词EB病毒,膜蛋白,昆虫杆状病毒,基因表达EB病毒(Epstein一BarrVirus,EBV)与人的多...

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  • 中国不同临床型来源的丁型肝炎病毒(HDV)部份基因组序列的分析比较

    谭文杰,苗季,丛旭,詹美云

    从我国河南、内蒙、北京等地的HDV健康携带者、慢性丁肝病人与重症肝炎病人中,筛选获得4份HDV—RNA阳性血清。经逆转录—聚合酶链反应(RT—PCR)交叉扩增获得HDV—cDNA片段(651—1660nt,按Makinoetal定位),并克隆到PGEM—3zf(-)或PGEM-T载体上。经序列分析研究其基因结构特点,结果表明,同属基因Ⅰ型的4株中国丁型肝炎病毒,在基因序列上具有相似的保守区域,但与同亚型HDV健康携带者相比,重症肝炎病人与慢性丁肝病人来源的HDV毒株,在多个位点上发生了核苷酸的改变,由此推导的抗原编码区相应的氨基酸发生了替换。这些核苷酸与氨基酸的改变位点散在,但多集中于抗原编码区的羧基端。如慢性丁肝发生的6个氨基酸改变中,5个位于166—188位;重症肝炎发生的12个氨基酸改变中,8个位于170—214位。有趣的是,在175位上发生了由脯氨酸向丝氨酸的共同替换。提示HDV的感染致病可能与HDV的基因结构相关。

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  • 戊型肝炎病毒结构区基因在大肠杆菌中的表达及其在诊断中的应用

    毕胜利,江永珍,赵洪兰,李景元,鲁健,曹经瑗,刘崇柏

    利用融合蛋白表达载体pGEX-3X表达了戊型肝炎病毒第二(ORF2)和第三读码框(ORF3)区的两个抗原表位,并利用ORF2表位上游自然存在的限制性内切酶位点和ORF3下游通过PCR引入的限制性内切酶位点,使两个免疫表位区域形成嵌合。表达的三种抗原均溶于水。可利用商品化的谷胱甘肽-4B亲合层析柱得到纯化的抗原。经试用发现,基因重组抗原作为酶联免疫试剂的抗原用于检测血清中抗戊型肝炎病毒抗体,与新加坡进口试剂盒有高度的一致性。

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  • 中国株丙型肝炎病毒(HCV)感染猕猴后5'NTR—C区基因组的cDNA序列分析

    夏宁邵,王海林,毕胜利,洪宁,田保平,郑延硕,刘敏,季维智,候云德

    从用于接种猕猴的受HCV感染的2份献血员的血清,第一代猕猴感染HCV11个月的1#食蟹猴血清和第二代猕猴受第一代猕猴HCV血清感染HCV3个月后的14#恒河猴血清,提取KNA,用自行设计的HCV5'非编码区和核心区(5'NTR—C区)引物进行逆转录PCR,将扩增的779bpcDNA片段克隆到pUC19质粒上;每一株挑3个克隆用双脱氧链终止法测定其序列并矫正偏差。4株HCV的5'NTR—C区序列,原代人A株(CX1)cDNA全长779bp,原代人B株(CX2)cDNA全长778bp,第一代猕猴株(CX3)cDNA全长776bp,第二代猕猴株(CX4)cDNA全长均为777bp,CX1株和CX4株均在5'NTRnt—216有—C的插入,CX3和CX4C区nt385—387处的3个硷基缺失;CX1株与CX2、CX3、CX4比较,同源性分别为98.07%。96.15%、95.25%:CX2与CX3、CX4的同源性分别为96.28%、95.76%;CX3与CX4的同源性为97.56%。由克隆的HCVC区cDNA推导的氨基酸序列,从HCV的启始密码起,CX1株、CX2株序列全长168个氨基酸,CX3株和CX4株序列全长

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  • 应用抗体捕捉聚合酶链反应(AC/PCR)检测贝类甲型肝炎病毒污染

    王秋红,方肇寅,吕作芝,周德水,章青,吴狄

    污染水体中生长的贝类是传播甲型肝炎的重要途径之一。本文介绍了一种抗体捕捉后进行PCR扩增来检测贝肉中甲肝病毒(humanhepatitisAvirus,HAV)的方法。贝肉中HAV的浓集回收采用洗脱一沉淀法井加以改进,用脊髓灰质炎病毒作为指示病毒,经二次沉淀后病毒的回收经率为26%,30克贝肉中的病毒浓集回收在1.0~1.5ml上清液中。此方法计算检测限<30-300HAV/3g贝肉。从14份大连海域标本中,用该法检测出阳性标本7份,阳性率为50%。此浓集病毒的方法还可应用于检测贝肉中污染的脊髓灰质炎病毒、诺瓦克病毒、轮状病毒等其它病毒。

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  • 用免疫蚀斑方法筛选重组痘苗病毒疫苗株

    谷淑燕,董温平,朱秋屏

    用间接免疫酶方法在硝酸纤维膜上检查、筛选和回收重组痘苗病毒。作为人用疫苗株的筛选,此法较核酸杂交方法更简便、直观和准确,在筛选重组病毒的同时确定了病毒在感染细胞上的表达。构建了含痘苗病毒7.5k启动子和EB病毒膜抗原基因的转移载体,从转染细胞的病毒混合液中用特异性McAb和间接免疫酶方法直接筛选表达EB病毒膜抗原的重组痘苗病毒,并从阳性酶斑中回收具感染性病毒。

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  • 基因治疗研究中有复制能力逆转录病毒的检测

    卢大儒,邱晓云,郑冰,邱信芳,薛京伦

    在反转录病毒介导的基因治疗研究的过程中,建立了有复制能力的反转录病毒(RCR)的检测系统,包括DNA聚合酶链式反应(PCR)、反转录PCR(RT/PCR)、Southem杂交以及nec基因和β-gal基因的补救分析(Rescueassay)。从DNA水平、RNA水平和病毒活体水平对野生型病毒进行了灵敏而特异的检测,套式PCR灵敏度达2.5个拷贝,并利用该检测系统检测了血友病B基因治疗和脑胶质瘤基因治疗的靶细胞及有关样品,所有结果均为阴性,没有检测到野生型反转录病毒。为基因治疗临床试验的安全进行奠定了基础。

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  • 逆转录病毒载体介导人GM-CSF基因在膀胱癌细胞株的转移和表达

    陈庆华,宋永胜,李小宇,张智清,郭应禄,侯云德

    本文报道制备转基因膀胱癌瘤细胞疫苗的可行性。将CMV启动子片段和人粒细胞一巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)cDNA,克隆进逆转录病毒载体N2A,构建逆转录病毒表达载体N2A/CMV/GM—CSF,经Lipofectin包装并转染包装细胞,获得重组逆转录病毒。选择较高滴度的重组病毒(滴度为1×10 ̄5~2×10 ̄6CFU/ml)感染人膀胱癌细胞株BIU—87,经G418筛选出转基因瘤细胞株BIU ̄R。PCR和Southernblot检测证实GM—CSF基因已整合到其DNA上,RT—PCR可检测到转基因细胞中GM—CSF基因的表达。细胞培养上清经TF—1细胞检测,其GM—CSF分泌量为0.7~70.7ng/10 ̄6细胞/24小时。荧光免疫测定发现转基因瘤细胞表面有HLA—Ⅰ、Ⅱ类抗原表达。转基因瘤细胞株经6000radX射线照射灭活,细胞逐渐死亡,但能持续分泌GM—CSF达两周以上。初步动物试验结果表明,转GM—CSF基因的瘤细胞疫苗具有明显的抑制肿瘤生长的能力。

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  • 牛免疫缺陷病毒长末端重复序列(BIV一LTR)在大肠杆菌中的启动子功能

    陈宙涛,梁臣,刘淑红,耿运琪

    牛免疫缺陷病毒(BIV)的长末端重复序列(LTR)含有病毒的启动子,调控病毒在真核细胞中的表达。我们将BIVLTR与萤火虫荧光素酶基因连接构建成重组质粒pBIV一Luc,该质粒能在Ecoli中有效地表达出荧光素酶的活性,从而证明BIVLTR在大肠杆菌中也具有启动子功能。Mungbean核酸酶作图分析发现,BIVLTR在Ecoli中的转录起始位点位于U_3区,而不是在真核细胞中的U_3一R交界处。同时我们也证实了BIVLTR在E,coli中仍可被BIVtat蛋白特异性地反式激活,为研究tat蛋白的作用机制提供了一条新的途径。

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  • 应用套式PCR检测猪细小病毒

    王汉中,梁莉

    从猪细小病毒(PPV)基因组的VP2基因上,选择两对引物进行套式聚合酶链反应(NestedPCR)体外扩增,产物经2%agarose凝胶电泳和生物素标记的探针鉴定,证实具有特异性。敏感性实验证明,套式PCR能检测到1TCID_50的病毒量,在临床上应用本方法能从不同的组织样品和粪便中检测出猪细小病毒,具有很高的敏感性。

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  • 用聚合酶链反应检测产蛋下降综合症病毒核酸的研究

    张兹钧,胡木枝,金由辛

    根据对EDS一DNA重组质粒pTEZ.P3和pTEZ.P28的核酸序列分析结果,设计了两对引物,它们均能从EDS一DNA上扩增出一个特异片段,其长度分别为238bp和209bp。经比较,PCR比血球凝集试验至少灵敏200倍,比核酸杂交试验灵敏千万倍;对100份自然发病鸡的肛拭子、血液和软壳蛋等样品的检测结果表明:PCR的阳性检出率远高于核酸杂交试验,并用病毒分离方法证实了PCR对野外病料的检出结果是可信的,对常规的PCR条件还作了改进,使试剂的用量减少了10倍以上,并简化了一些烦琐操作。

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  • 黄瓜花叶病毒香蕉株系衣壳蛋白转基因烟草的研究

    李华平,胡晋生,范怀忠

    构建了侵染香蕉的黄瓜花叶病毒(CMV)两个株系(BS和HI)的衣壳蛋白(CP)基因的植物表达载体,并通过农杆菌共培养法和基因枪法,分别将两个株系的CP基因转化入了两种烟草植株。其CP基因转化频率及植株再生率研究结果表明,农杆菌共培养法比基因枪法、土耳其烟比本生烟、农杆菌1:10倍稀释液比培养原液和1:100倍稀释液,具有更高的转化频率和植株再生能力。Southernblot和PCR一Southernbolt检测CP基因整合研究结果表明,在两株系CP基因转化的各12株烟草中,各有9株含有各自的CP基因。Northernbolt分析表明,在各7株转基因植株中,各有5株具有各自CP基因的mRNA的转录。DAS一ELISA检测表明,各5株转基因植株中都含有各自株系不等量表达的CP。用HI株系进行攻击接种表明,具有mRNA转录和翻译的两株系的各5株转基因植株都显示了较高的抗病水平。

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