• 痘苗病毒天坛株非必需区TA25R…TA36L的两步重组表达载体的构建

    邹艳,阮力,娄元梅,朱诚,陆柔剑,孙朝晖,朱既明

    针对痘苗病毒天坛株非必需区TA25R-TA36L,构建了可去除TA26R至TA35L的10个ORFs,并同时表达LacZ基因的两步重组表达载体pA2427LacZ。通过两种方法(一步重组和两步重组)获得了在该区域表达LacZ基因的重组痘苗病毒RVA2427LacZ。实验表明,一步重组法获得重组病毒的机率大约为1‰,两步重组法的机率可达62.5‰。由此可见,两步重组法可显著提高重组病毒的筛选机率。LacZ基因可以在该区域中稳定表达,重组病毒与野毒株在繁殖能力上没有明显差别,表明TA25R-TA36L是较稳定的外源基因插入区域。上述结果对于深入研究该非必需区的功能特点,进一步利用该非必需区进行外源基因表达和疫苗株研究奠定了基础

    1998年02期 3-5页 [查看摘要][在线阅读][下载 65k]
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  • 人乳头瘤病毒6b型H增强子样序列在大肠杆菌中增强基因转录和β-干扰素表达

    李同据,吴淑华,韩峰,薛水星,王金涛,刘哲伟,杨佩英,侯云德

    将人乳头瘤病毒6b型(HPV6b)基因组上游调控区(URR)540bp的Sau3A-NarI片段(H序列),正反向插入β-干扰素表达载体Trp启动子上游,使β-IFN表达明显增强,可使基因表达水平提高3.6倍(正向)和2.1倍(反向)。H序列正反向插入增强子检测载体不仅使β-半乳糖苷酶表达活性增加5-10倍,还能使半乳糖苷酶mRNA量明显增高,证明H序列对被调控基因的增强作用是发生在转录水平。

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  • 表达人GM-CSF重组痘苗病毒抗肿瘤作用的实验研究

    刘红兵,张智清,姚立红,侯云德

    将hGM-CSFcDNA插入含有P11k及P25k双向启动子的痘苗病毒载体pJ120的P11k启动子下游,而P25k下游则为LacZ基因,构建成表达质粒pJ120/GM-CSF。以此质粒与痘苗病毒天坛株共转染TK-143细胞,在BUdR存在下,利用蓝斑筛选及纯化获得重组病毒RVJ120/GM-CSF,Southernblot和PCR-Southernblot结果均证实,重组病毒DNA中GM-CSF基因整合,TF1测活显示重组病毒可表达有活性的GM-CSF,且分泌到上清中。将表达GM-CSF的重组痘苗病毒体外感染肿瘤细胞制备的裂解物,接种于荷瘤大鼠,能明显地抑制大鼠Walker实体瘤的生长。这为肿瘤的治疗提供一条新途径

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  • 中国河南两株庚型肝炎病毒(HGV)NS5区部分cDNA的克隆与序列分析

    谭文杰,陈刚,夏宁邵,黄鹤丛,郁苗季,詹美云

    通过逆转录-聚合酶链反应从我国河南省2例重叠感染HCV或HBV/HDV的献血员中,分离到HGVNS5区的部分cDNA,对其进行序列分析比较,结果表明:河南株HGVNS5区核苷酸与两株中国HGV株的同源性(>91.9%)高于国外代表株(88.5%-90.6%),但由核苷酸推导的氨基酸的同源性都无明显的地区性区别。HGVNS5区氨基酸序列较保守(同源性>91%),缺乏明显高变区。中国4株HGV在7384位发生了由C→T的变异,从而导致一个共同的保守位点的产生(由F→A)。重叠感染其他肝炎病毒时,河南株HGVNS5基因结构并无特异性改变

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  • 汉滩病毒糖蛋白G1 G2和核蛋白NP在痘苗病毒天坛株中的联合表达

    姚树元,杭长寿,邱建明,马章亮,李德新,薛颖,李川,宋干

    将汉滩病毒76/118株M、S片段分别插入转染质粒pJSB1175的P11和P7.5启动子下游,构建成重组质粒pJSB11M7.5S。采用Lipofectin转染技术将重组质粒分别与痘苗病毒天坛株TK+vv和表达S片段的重组痘苗病毒vJSA1175S进行共转染,免疫酶斑和蓝白斑法筛选并纯化,得到了重组病毒vJSB11M75S。Budr的选择压力试验表明,外源基因确实插入在TK基因区;PCR及打点杂交证实了两个片段的插入;重组痘苗病毒基因组的部分序列分析显示,两个片段与各自的启动子连接正确;间接免疫荧光及放免沉淀证明了糖蛋白G1、G2和核蛋白NP的表达。重组病毒能够在试验动物中诱导产生中和抗体

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  • Epstein-Barr病毒潜伏膜蛋白(LMP)基因免疫的初步研究

    纪志武,臧卫东,谈浪逐,曾毅

    利用基因免疫技术,将重组质粒pBS-LMP-Hyg直接注入BALB/C小鼠骨骼肌中,于第2、4、8周,用间接免疫荧光法检测鼠血清中抗EB病毒潜伏膜蛋白(LMP)特异抗体,结果表明,所有免疫小鼠(5/5)均产生特异抗体,且抗体滴度随时间变化逐渐增高

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  • 北京地区G1-G4型人轮状病毒地方株VP7编码基因的序列分析

    李国华,钱渊,熊朝晖,靖宇

    本文报告了北京地区流行的4个轮状病毒地方株(G1-G4)VP7编码基因的核苷酸序列。4个地方株的该基因核苷酸全长均为1062bp,读码框架和已往的研究一致。地方株和相同血清型的标准株之间VP7氨基酸序列具有高度同源性(92%-94%),而不同血清型间则变异较大(69%-80%)。不同血清型间氨基酸序列的变异主要存在于高变区内,高变区以外的区域在不同血清型轮状病毒间保守。这一序列分析结果进一步从分子水平分析了地方流行毒株的血清型别,揭示了轮状病毒地方流行毒株和标准株之间VP7序列的变异情况

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  • Epstein-Barr病毒诱导永生化人上皮细胞恶性转化

    李宝民,纪志武,刘振声,曾毅

    为了使EB病毒能直接感染人上皮细胞,将pSG-CR2-Hyg载体转入永生化人上皮细胞(293细胞)中。通过间接免疫荧光法测定发现,转化的细胞表达EB病毒受体。用EB病毒感染CR2-293细胞后,23%的细胞可表达EB病毒抗原。用TPA作用于这些细胞后,表达病毒抗原的细胞数增加。用PCR法从EB病毒感染细胞DNA中扩增出EB病毒DNAW片段。在TPA持续作用下,EB病毒感染细胞的形态特征发生改变。把EB病毒感染细胞接种在裸鼠皮下,每周注射TPA,可诱导细胞在裸鼠体内形成肿瘤。经组织病理检查确诊,肿瘤为低分化上皮细胞癌。杂交试验证明,肿瘤组织细胞中有EB病毒EBERs存在。上述结果表明,EB病毒在TPA协同作用下,可诱导永生化上皮细胞恶性转化。

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  • 应用套式PCR对恶性卡他热病毒在不同动物体内变异的研究

    童光志,李弘

    应用本实验建立的三组套式PCR(PCR1、2、3)和一组以前报道的套式PCR(PCR4),对59份外周血淋巴细胞(PBL)DNA样品进行了恶性卡他热病毒(Malignantcatarrhalfevervirus,MCFV)核酸序列的检测。这些样品来自51只羊,以及与羊接触而发病的6头牛和2只鹿。除PCR4外,其它三组PCR都能扩增现有4个角马型MCFV分离株。有6只羊在4组PCR中都呈阴性,其余53份样品经PCR4检测均呈阳性。PCR1只能从45只羊体检出MCFVDNA,未能从牛和鹿体检出病毒DNA。PCR2检测的所有样品均呈阴性。在PCR3扩增中,除2头牛外,其它51份样品均呈阳性。通过Southern杂交和限制性酶切分析,对PCR1-4产物的特异性进行了鉴定。此外,敏感性实验表明,四组PCR的差异也不明显。因此,本实验结果说明MCFV基因组在不同种动物之间发生了变异,羊体内的变异株可能是导致其它反刍动物发病的病原

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  • 由反转录病毒载体转移的马立克病毒糖蛋白D基因在感染细胞中的表达

    段玉友,崔治中,秦爱建,殷震,杨冠珍,吴祥甫

    用EcoRI、PstI将已分离和克隆的马立克氏病病毒糖蛋白D(gD)基因从重组pMgD18质粒中切出,克隆进反转录病毒质粒载体(RCAS)的连接质粒载体pUCCla112N的相同位点。用ClaI再将gD重组pUCCla112N中的gD基因切出,构建于RCAS的ClaI位点。通过原位杂交筛选重组RCAS,并结合酶切分析鉴定出gD插入方向正确的重组RCAS。用磷酸钙沉淀法将gD重组RCAS转染鸡胚成纤维细胞(CEF),转染后第9天收集细胞上清,用其感染原代CEF,在感染后第4天和第6天收集CEF。提取CEF基因组DNA,用Digoxigenin(Dig)标记gD基因片段作为探针,通过Dot和Southernblot检测基因转移情况。用上述上清再次感染原代CEF,在第6天用异硫氰酸胍-氯化铯离心法提取感染细胞总RNA,用Dig和32P标记gDDNA为探针,分别用Dot和Northernblot检测MDVgDmRNA。结果表明,转染的重组RCAS不仅在细胞内成熟为具传染性的完整病毒,而且成功地将gD基因在感染细胞中被转录和表达

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  • 特异切割马铃薯卷叶病毒复制酶基因负链的核酶研究

    杨静华,哈斯阿古拉,梁成罡,张鹤龄

    根据锤头状核酶的作用模式,设计、合成并克隆了特异性切割马铃薯卷叶病毒中国分离株(PLRV-Ch)复制酶基因负链RNA的核酶序列。以体外转录的PLRV-Ch复制酶基因负链RNA作为底物,与转录的核酶RNA共同保温,以检测核酶对底物的体外切割作用。实验结果表明,核酶RNA对PLRV-Ch复制酶基因负链RNA具有特异切割作用

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  • 戊型肝炎病毒(HEV)合成肽及基因重组抗原免疫反应性研究

    戎广亚,孙杰,周继文,任继明,赵桂兰,雷祖才,张芳,王志杰,王雪飞,杨守纯

    用ORF2、ORF3合成肽抗原(1~10号)及基因工程重组的ORF2抗原(1和2号)分别建立了酶联免疫方法(EIA),检测60份戊型肝炎病人血清中HEVIgG及IgM10个合成肽抗原(Sp1-Sp10)及2个重组抗原(Re1、Re2),均和HEV阳性血清发生特异反应,但阳性率和反应强度差别很大。以Re1(ORF2,402~660)检测的抗体阳性率最高,为96.7%(58/60);Sp6(ORF3,88~123)次之,为93.3%(56/60);以上两种抗原混合使用阳性率为100%(60/60)。Sp6、Re1及这两种抗原混合使用检测抗HEVIgM,阳性率分别为18.3%(11/60)、66.7%(40/60)和66.7%(40/60)。研究结果表明:合成肽6号(Sp6)及重组抗原1号(Re1)是制备戊肝抗体诊断试剂的理想抗原。

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  • B组轮状病毒RT-PCR来源的cDNA探针核酸诊断方法的建立

    韩新兵,王正党,黄嘉驷

    近十年来,国内外学者相继报道在人以及牛、羊、猪、大鼠的腹泻粪样中检出B组轮状病毒〔1-3〕。洪涛等于1983年首次报道成人腹泻轮状病毒(ADRV)属于B组轮状病毒〔4〕。目前,轮状病毒B组已被公认为引起人及不同动物腹泻的流行病学的重要因素。由于B组轮...

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  • 粘虫核型多角体病毒多角体蛋白基因结构和序列的研究

    测定了粘虫核型多角体病毒(Leucaniaseparatanuclearpolyhedrosisvirus,LsNPV)两个EcoRV片段的共1201bp序列,发现了一个714bp的开放阅读框(ORF),根据其与多种NPV多角体蛋白基因(ocu)同源性的比较和5'端典型的14bp保守序列,说明此ORF即为LsNPV的ocu基因。根据核苷酸序列预测的多角体蛋白有246个氨基酸,其中酸性和碱性氨基酸数相等,疏水氨基酸含量很高,氨基酸组成中以谷氨酸(Glu)含量最高,谷氨酰胺和半胱氨酸含量最低。编码区碱基同源性与MbNPV最高,为97.0%;氨基酸同源性与MbNPV最高,为97.5%。密码子偏爱选用以第三个碱基为嘧啶的密码子。二级结构分析表明,α-螺旋(H)和β-折叠(S)相等,β-转角含量是H和S含量之和。

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  • 甜菜坏死黄脉病毒内蒙分离物RNA3序列分析及编码25kD蛋白基因在大肠杆菌中的表达

    李大伟,于嘉林,韩成贵,邢怡明,刘仪,陈受宜

    以甜菜坏死黄脉病毒(BNYVV)内蒙分离物的总RNA为模板,通过反转录-PCR扩增获得BNYVVRNA3全长cDNA。将其克隆到pGEM-7Zf(+)上,得到重组质粒pGBY56。序列分析结果表明,内蒙分离物RNA3基因组全长为1775nt,其中包含3个开放阅读框架,分别编码25kD蛋白、4.6kD蛋白和一种由59个氨基酸组成的N蛋白。与法国F2分离物、德国G1分离物和日本S分离物相比,其核苷酸序列的同源性分别为96.4%、96.8%和97.3%。将25kD蛋白编码基因克隆到pJW2上,构建了该基因的原核表达载体。SDS-PAGE和Westernbloting分析结果表明,25kD蛋白基因在E.coliBL21(DE3)中经温度(42℃)诱导后,可特异地表达25kD蛋白

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  • 马立克氏病病毒基因结构与功能及其基因工程重组疫苗的研究现状

    李茂祥,金奇,殷震

    马立克氏病病毒(Marek'sDiseaseVirus,MDV)主要侵害鸡的性腺、神经、肌肉、皮肤、虹膜及各内脏器官,引起单个或多个组织器官的淋巴细胞增生和单核细胞浸润,是对养鸡业危害最为严重的传染病病原之一。该病最初由匈牙利病理学家J.MareK报...

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