• HSV-tk/NAS系统基因治疗脑肿瘤中野生型腺病毒的检测及其安全性

    卢大儒,王琪,崇松,王之敏,邱信芳,薛京伦

    在腺病毒介导的HSV-tk/NAS系统脑肿瘤基因治疗研究过程中,建立了野生型腺病毒(RCA)的检测系统,主要包括腺病毒E1区的PCR以及野生型病毒的细胞病理效应观察这两种方法,PCR的灵敏度为1个293细胞所含有的E1片段数。对基因治疗脑肿瘤所采用的重组腺病毒AdTK及其感染的细胞进行RCA的检测,没有发现RCA。通过离体实验首次发现,重组腺病毒对脑肿瘤细胞的杀伤作用明显高于正常的脑胶质细胞;大鼠和兔脑内原位注射重组腺病毒AdTK,并腹腔注射GCV,正常脑组织只有轻微的病理改变,脑内可检测的重组腺病毒不超过4周;小鼠和大鼠尾静脉注射重组腺病毒和腹腔GCV治疗,除肺和肝脏有GCV引起的炎症反应外,其他主要脏器没有病理改变。

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  • 肝细胞导向的促血小板生成素基因转移对化疗后血小板减少症模型治疗的初步研究

    王虹,吴小林,颜子颖,侯云德

    为了探讨受体介导的基因转移技术在治疗血小板减少症方面应用的可行性,将促血小板生成素(Thrombopoietin,TPO)基因克隆入质粒型EB病毒表达载体pDR2中,并与半乳糖化组蛋白结合,从而制备了一种为肝细胞表面特异的脱唾液酸糖蛋白受体识别并内吞的核酸-蛋白复合物。在经化疗药物卡铂诱发的血小板减少症的实验动物大鼠中,同时静脉注射该复合物,可将TPO基因特异地导入肝细胞并在其中得到表达。从而有效地阻止了血小板减少症的发生,提示了一种以非病毒感染方式对化疗后血小板减少症进行有效基因治疗的可能前景

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  • 1996年延边地区无菌性脑膜脑炎病因病毒的分离及初步鉴定

    陈立,李玉雨,郑红,李主宣,李杰,蒋小泓,尹永日,李英信,方勇,祝双利,张礼璧

    吉林省延边地区1996年6月发生无菌性脑膜脑炎流行,在全地区216万人口中,发病人数约5~6千人,死亡2人,为历史上所罕见。从病人脑脊液和粪便标本中分离到多株病毒,分离率较高(分别达到52.4%和66.7%)。用WHO提供的RIVM肠道病毒组合血清进行中和定型,不能确定型别。RT-PCR结果表明为肠道病毒。病人早期血清特异性IgM抗体阳性率72.0%,证明所分离的病毒为此次无菌性脑膜脑炎暴发流行的病因。此病毒为肠道病毒,有可能是肠道病毒的一个新型别或变异株。有关的研究正在深入进行

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  • 汉滩病毒 A9 株M基因片段在重组痘苗病毒中的表达及鉴定

    马章亮,杭长寿,邱建明,姚树元,宋干

    为发展国产化肾综合征出血热(HFRS)病毒基因工程疫苗,选择了汉滩病毒A9株M基因片段为目的基因,构建转染质粒pJSBA9M。以携带Lac基因的重组病毒为亲本,使表达载体pJSB-A9M上的M片段与痘苗病毒内的Lac基因重组,将Lac置换成A9M片段。用蓝白斑法筛选重组痘苗病毒,经PCR扩增证实A9M片段重组入痘苗病毒基因组内。重组痘苗病毒感染的VeroE6细胞,用抗糖蛋白单克隆抗体(HCO2、11E10、3D5、16D2)间接免疫荧光法检测,呈阳性反应;放射免疫沉淀法(RIP)证实,表达产物可与抗G2的糖蛋白单克隆抗体出现特异性沉淀带;间接免疫荧光染色法检测表明,重组病毒免疫Balb/c小鼠的血清与A9株感染的VeroE6细胞有较好的特异性反应(1:320),说明A9M片段在痘苗中表达成功。这为发展出血热病毒基因工程疫苗提供了一种可能的途径

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  • 大鼠甘氨肽α-羟化单氧酶在昆虫细胞中的活性表达

    江智红,黄荣,杨宇虹,吴祥甫,李伯良,王德宝

    将编码大鼠甘氨肽α-羟化单氧酶(PHM)cDNA基因,插入昆虫杆状病毒转移表达载体pBacPAK8,构建成表达质粒pBacPHM2,与修饰的银纹夜蛾核多角体病毒BacPAK6线性化DNA共转染秋粘虫细胞Sf21,通过同源重组,得到在核多角体蛋白基因启动子控制下的PHM基因的重组病毒BacPHM。用BacPHM感染Sf21细胞,无血清培养上清在72小时后检测到酰胺化酶最高活力;用细胞免疫组化法和免疫印迹法检测表达产物,胞内及胞外培养上清液中均显示有约41kD的PHM表达产物,胞内、胞外产量分别约为5μg/105细胞数、1μg/ml培养基/105细胞数,且分泌至培养基中的酶活力远高于胞内。昆虫细胞中表达的PHM可直接用于甘氨肽的酰胺化修饰

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  • 鸡减蛋综合征病毒(EDSV-76)基因组E1区结构特点分析

    金奇,曾力宇,李茂祥,殷震,侯云德

    EDSV-76病毒中国株AA-2经常规方法提取其病毒DNA后,建立了限制性内切酶PstI水解片段的全基因文库。对其中PstI-G片段和PstI-A片段的正反链进行序列测定,获得EDSVE1区(0-8.8m.u)的核苷酸序列。经分析,EDSVE1区具有与其他腺病毒E1区类似的结构。以大于60个氨基酸残基为标准,EDSVE1区共有7个开放读码框架(ORF),其中R1、R2、ElbsT和E1b1T由r链编码,其余分布在L链上,而且一些与腺病毒复制、转录有关的基序在EDSVE1区中也较为保守。

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  • 用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统高效表达绿色荧光蛋白标记的HBVe抗原

    岳莉莉,齐义鹏,杜全胜,李燕

    通过基因工程操作,使乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)基因与绿色荧光蛋白基因(GFP)融合,用新型Bac-to-Bac杆状病毒表达系统在昆虫细胞中高效表达了HBeAg-GFP双功能融合蛋白。经ELISA法和荧光显微镜观察证实,表达产物既能发射易于检测的绿色荧光,又具有HBV的e抗原活性,为免疫诊断新方法的建立进行了有益的探索

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  • 广西壮族自治区HIV-1流行毒株的基因序列测定和亚型分析

    陈杰,苏玲,梁绍伶,刘伟,刘小良,梁富雄,邢辉,李荣建,邵一鸣

    使用PCR技术对14份广西HIV-1阳性感染者外周血单核细胞(PBMCs)样品进行扩增,获得HIV-1膜蛋白(env)基因的核酸片段,并对其C2-V3及邻区350-450个核苷酸序列进行了测定和分析。结果表明,14份样品中9份为泰国B(B′)亚型,5份为E亚型毒株。其中B′亚型毒株的基因离散率为4.2%,与A-E参考亚型及部分B亚型代表株序列相比较,与包括泰国、缅甸及云南德宏在内的B亚型毒株序列十分接近,相互之间基因离散率在3.0%-4.4%的范围内;而E亚型毒株的基因离散率为2.1%,与国际E亚型毒株的基因离散率最近,为5.6%,与其它国际参考亚型基因离散率很远,在21.1%-27.3%。根据以上数据及其它资料提示,广西存在B′和E两种亚型的HIV-1的流行,且其B′亚型毒株的传入,与流行在云南德宏州的相同亚型HIV-1毒株密切相关,而E亚型毒株则可能是由泰国经越南传入广西的

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  • 猪瘟病毒石门株与兔化弱毒株gp55基因的克隆与序列分析

    李红卫,涂长春,金扩世,王新平,殷震

    猪瘟病毒石门系强毒株及兔化弱毒疫苗株(HCLV株)是我国的标准毒株,囊膜糖蛋白gp55(又称E1)是该病毒最重要的保护性抗原。本实验采用反转录PCR扩增了这两个毒株的gp55基因。序列分析结果表明:1.石门株和兔化弱毒株糖蛋白E1的氨基酸序列含有15个半胱氨酸残基(Cys),其数量及位置与国外4株猪瘟病毒(Alfort、Brescia、ALD和GPE-)完全一样。E1中Cys的数量及位置的保守性说明,该病毒这一保护性抗原在各毒株之间具有相同的骨架结构。2.E1糖蛋白N端的信号肽序列及C端的跨膜区序列是比较保守的,然而位于N端的抗原区序列是非保守的,其中氨基酸变异较大的区域大约在702~742氨基酸残基之间。3.所测得的HCLV株E1的氨基酸序列,与国外测得的HCLV株E1的氨基酸序列有明显差异,这一差异均一地分布于整个E1序列。因此,推测国内外同出一宗的HCLV疫苗株,在长期的使用传代过程中发生了一定程度的遗传变异。

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  • 中国不同来源狂犬病病毒野毒株G基因主要功能区的序列分析

    钱爱东,侯世宽,何昭阳,李红卫,涂长春,殷震

    对我国不同来源的狂犬病病毒野毒株8202、BRV、MRV的G基因405~1146位核苷酸序列,进行了逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增、克隆和序列测定,并应用计算机对这3个毒株的测定序列和已发表的中国人源毒株(CGX89)的相应序列进行了分析比较。结果表明,这4个中国不同来源狂犬病病毒的G基因同源性较低,8202与BRV的核苷酸同源性只有79.5%,与MRV的氨基酸同源性亦只有82.2%;同一地区自不同动物分离的MRV株与BRV株其亲缘关系较远。4个野毒株的糖基化位点和主要的诱导中和抗体产生的抗原决定簇内某些氨基酸亦不同,从而证明我国存在亲缘关系较远的狂犬病野毒株,甚至存在基因型的差异

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  • 传染性法氏囊病病毒VP_3结构蛋白基因在大肠杆菌中的高效表达

    姜平,陈溥言,蔡宝祥,杨奎,郑明球

    传染性法氏囊病病毒(IBDV)是危害养鸡业的重要病原之一,属双股双节段RNA病毒科成员,由A和B两个片段的dsRNA构成,大小分别约3300-3400bp和2800-2900bp。基因片段A首先编码VP2-VP4-VP3聚合蛋白,然后再断裂成VP3、...

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  • 病毒抗感染免疫应答的防御机制

    周俐梅,王嘉玺

    许多哺乳动物病毒能以潜伏性或持续性感染的方式在其宿主体内长期稳定地存在,这是因为在长期进化过程中它们已具备了多种对抗宿主体内抗感染应答的防御机制,所以能逃避宿主免疫系统的严密监测及破坏。大型DNA病毒尤其明显,如痘病毒、疱疹病毒和腺病毒。因为它们的基...

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  • 戊型肝炎病人血清抗-HEV IgG与IgM和HEV RNA的动态变化

    戎广亚,孙杰,周继文,任继明,杨守纯

    利用酶联免疫试验(EIA)及逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR),检测了210份急性非甲非乙非丙肝炎患者血清和40例戊型肝炎(戊肝)病人系列血清。在急性非甲非乙非丙肝炎血清中,抗-HEVIgG、抗-HEVIgM和HEVRNA阳性率分别为62.86%、45.23%和40.48%。在戊肝系列血清检测中,抗-HEVIgG阳性率发病1个月内为92.5%,发病2~6个月100%,12个月94.7%,24个月48.6%。抗-HEVIgM阳性率发病1个月内为80%,发病2个月52.5%,6个月5%。抗-HEVIgG出现早,持续时间长,阳性率高。尽管大部分抗-HEVIgM阳性血清抗-HEVIgG也呈阳性,但也确有少数抗-HEVIgG为阴性的。结果表明,抗-HEVIgG检测是诊断戊肝感染最重要的方法,抗-HEVIgM检测对戊肝诊断也有一定帮助

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  • 应用反转录-聚合酶链反应检测口蹄疫病毒

    朱彩珠,卢永干,邱孝高,赵启祖,谢庆阁,张维德,员美蓉,杨福荣,张强

    建立了一种适用于检测动物(猪、牛、羊)组织(肌肉、淋巴结、脊髓、扁桃体和蹄冠皮)和牛食道-咽部分泌物(O-P液)中的口蹄疫(FMD)病毒核酸(RNA)的反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术。引物对是人工合成的两条20mer寡核苷酸片段,它们的序列相应于FMD病毒结构蛋白VP1基因后2/3区段,在4个血清型之间基本一致(保守)。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测。试验结果表明,RT-PCR具有良好的特异性,属该4个血清型的各个毒株都获得了预计长度的DNA片段;而相关的小RNA病毒科的猪水泡病(SVD)和柯赛奇B5(Cox.B5)病毒(特异性对照),及未感染的细胞培养物和动物组织(空白对照)都是阴性。与常规检测方法相比,该RT-PCR的检测灵敏度提高6-12倍,最高可检测20TCID50(细胞毒)或0.16~0.32LD50(组织毒)的病毒量,二次扩增还可提高检测灵敏度100倍。因为直接利用组织样品,检测试验快速简便,可在24小时内获得结果。应用该方法已检测了232份组织样品和58份O-P液样品,都获得了满意的结果

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  • 重组含有Epstein-Barr病毒潜伏膜蛋白1(LMP1)基因的杆状病毒在昆虫细胞中的表达

    周玲,刘海鹰,柯越海,王汉明,马林,曾毅

    用杆状病毒表达系统重组病毒,在昆虫细胞中表达了完整的含有EBV-LMP1基因3个外显子开放读码框架的长2.3kb的cDNA片段。用重组病毒感染Sf9细胞,用免疫荧光染色,结果表明:48小时表达重组蛋白,72小时细胞较完整,免疫荧光染色强阳性,96小时后细胞出现破碎。我们采集72小时的组织培养上清和细胞破碎裂解液,分别采用SDS-PAGE、HPLC分子筛法,用免疫蛋白印迹法实验证明,表达的蛋白能被抗LMP1的单克隆抗体所识别,测定表达蛋白的分子量为60kD。经蛋白含量扫描图分析,采用Sephadex-75柱初步纯化表达的LMP1蛋白,将后者进行裸鼠体内致瘤实验,未见肿瘤生长。

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  • 硫代反义寡核苷酸在细胞培养内抗甲型流感病毒活性

    陈忠斌,王升启,朱宝珍,孙志贤

    为了研究抗流感病毒特异性反义核酸药物,针对A型流感病毒基因组3′和5′端保守序列,设计并合成了4条硫代寡核苷酸(ODN):3′端反义ODN(IV3#)与3′端正义ODN(IV3S),5′端反义ODN(IV4#)与5′端正义ODN(IV4S)。以流感病毒血凝滴度和致细胞病变作用为指标,测定了ODNs在MDCK细胞中对A型流感病毒A/京防/86-1(H1N1)复制的影响。结果表明,与流感病毒基因组5′端互补的ODNIV4#为1μmol/L时,对病毒复制抑制率近50%,为10μmol/L或更高时,抑制率超过70%,IV4#抑制病毒活性呈序列和剂量依赖性。为了提高IV4#的细胞摄取效率,对其进行脂肪链修饰,并在lipofectin转染条件下考察了对病毒的抑制作用。结果发现,脂肪链修饰的IV4#抑制病毒活性无明显增高;lipofectin能显著提高IV4#及其脂肪链修饰物抑制病毒活性。反义寡核苷酸IV4#为进一步研究人流感新型药物奠定了基础

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  • Epstein-Barr病毒膜抗原基因免疫的研究

    叶萍,李燕,谷淑燕

    将Epstein-Bar病毒(EBV)膜抗原(MA)BLLF1基因,插入含有CMV启动子的真核表达载体pcDNA3下游BamHI位点,构建成真核表达质粒pcDNA3-MA。将纯化的DNA注射Balb/c小鼠股四头肌。经免疫的动物产生抗EB病毒MA特异性的抗体和中和抗体,依赖抗体细胞介导的细胞毒作用(ADCC),特异性T淋巴细胞增生性反应及细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀伤作用。基因免疫与基因-蛋白联合免疫效果相似。不同启动子控制下的MA基因,诱发小鼠免疫应答无明显差异。

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