- 罗文新,李利峰,许辰煜,程通,管宝全,张军,夏宁邵
通过RT-PCR方法从分泌戊型肝炎(戊肝)病毒中和性鼠源单克隆抗体(单抗)8C11的杂交瘤细胞中克隆出抗体基因的重链可变区(VH)、轻链可变区(VK)序列,并分别克隆到含有人gamma1重链和kappa轻链恒定区序列的pcDNA3 1/Hygro和pcDNA3 1(+)质粒中,共转染中华仓鼠卵巢癌细胞(CHO)细胞。RT-PCR结果表明,转染的CHO细胞转录了嵌合重链及轻链基因,间接ELISA及Westernblot结果表明:翻译出的两种多肽在细胞内正确组装成嵌合抗体分子,并可分泌至细胞外,表达的嵌合抗体保留了原鼠单抗的抗原结合特异性及对8H3结合抗原的增强作用。8C11嵌合抗体的成功表达可降低鼠源性,为探讨戊肝抗体治疗的可能性奠定了基础。
2004年04期 291-297页 [查看摘要][在线阅读][下载 112k] [下载次数：234 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：413 ] - 刘合宾,刘克洲,翁景清,朱智勇
汉坦病毒是引起肾综合征出血热(HFRS)和汉坦病毒型肺炎综合征(HPS)的主要病原体。由S基因编码的核蛋白(NP)主要与机体的细胞免疫有关,并调节病毒的复制及诱导细胞程序性死亡。构建了汉坦病毒Z10株核蛋白cDNA与含有pac基因的反转录病毒鼠干细胞病毒(MSCV)重组体MSCV-FlagNP,通过磷酸钙转录法导入产病毒的包装细胞系BOSC23中,产生完整的重组MSCV-FlagNP病毒。然后以重组病毒感染NIH3T3细胞,利用Puromycin的选择特性(pac基因)对感染细胞进行连续压力筛选,获得了转核蛋白抗性细胞。利用Southernblot和PCR方法分别对核蛋白基因在抗性细胞染色体整合情况及其完整性进行了鉴定。并且用Westernblot在抗性细胞中可检测到核蛋白的表达。进一步以Flag单克隆抗体介导的免疫荧光染色联合共聚焦激光扫描荧光显微镜,分析了内源性Flag融合核蛋白在抗性细胞内分布,发现核蛋白主要分布于胞浆及胞核周围区,并且部分核蛋白可聚集形成胞浆包涵体。转核蛋白基因细胞模型的建立,对进一步研究汉坦病毒核蛋白功能以及病毒复制机制有重要意义。
2004年04期 298-302页 [查看摘要][在线阅读][下载 72k] [下载次数：140 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：359 ] - 王卫东,齐建国,谷淑燕,桑建利
构建了EB病毒核抗原1(EBNA1)基因的表达质粒pCI-EBNA1和泛素(ubiquitin,Ub)与EBNA1融合基因的表达质粒pCI-Ub-EBNA1。间接免疫荧光和Westernblot分析表明,两重组质粒转染HeLa细胞后均能瞬时表达。两种质粒DNA肌肉注射免疫Balb/C小鼠后,分别检测小鼠血清抗EBNA1的抗体和特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应,比较单基因与融合基因DNA免疫所诱生免疫应答的强度。结果显示:二者诱生抗体的效率无明显差别,但泛素的融合使得针对EBNA1的特异性CTL反应明显增强。
2004年04期 303-307页 [查看摘要][在线阅读][下载 82k] [下载次数：166 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：5 ] |[阅读次数：253 ] - 毛乃颖,许文波,杨秀惠,刘中华,严延生,潘伟毅,张勇
为研究ECHO13病毒中国分离株的分子特征及其与世界其它分离株之间的基因关系,对1998年、2000年从中国福建省分离到2株ECHO13病毒进行基因序列对比分析。2株病毒分别命名为Fujian98-1和Fujian00-1,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增出VP1蛋白编码基因全长861个核苷酸片段并进行序列测定,将2株E CHO13病毒的VP1序列与所有已发表的ECHO13病毒VP1基因全长进行同源性比较。结果显示,福建分离株之间核苷酸同源性为79 6%,氨基酸同源性为93 4%;与遗传距离最近的法国CF1089-91(AJ537604)毒株的核苷酸同源性分别为80%和88%,与代表株DelCarmen的核苷酸同源性分别为75 8%和77 9%。通过VP1基因分析,福建2株病毒均属于ECHO13病毒,与血清中和试验鉴定结果一致。下载所有已发表的ECHO13病毒VP1序列并构建进化树,发现福建2株病毒分属不同的分枝,提示这2株病毒来自不同的病毒传播链。进一步分析发现,整个E CHO13病毒可划分为3个不同的基因型:A、B和C基因型。福建Fujian98-1和Fujian00-1分别被划分在基因型B和C中,各基因型之间的核苷酸差异均大于20%。为验证该分型方法,将26株来自不同国家和时间的ECHO13病毒和2株福建分离ECHO13病毒部分VP1基因序列进行对比分析,建立进化树。结果显示,所有ECHO13病毒被分在A、B和C3个基因
2004年04期 308-314页 [查看摘要][在线阅读][下载 99k] [下载次数：139 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：27 ] |[阅读次数：450 ] - 周小云,刘颖,饶力群,王芙,戴凯凡,段丹丽,邵一鸣
为构建适用于疫苗株筛选的痘苗病毒载体,利用标记瞬时稳定的原理,在痘苗病毒单选择标记载体psc65的基础上,构建成带有neo和LacZ双选择标记的痘苗病毒载体pVI75。为检验载体pVI75的有效性,将HIV-1合成基因syngpnef插入到载体pVI75上,构建成转移质粒pVI75-syngpnef,并与天坛株752-1痘苗病毒共转染CEF细胞。筛选得到的重组病毒经PCR和Dotblot检验表明,标记基因已被删除,而目的基因被整合到痘苗病毒基因组上。Westemblot检测结果表明,目的基因的表达正确。痘苗病毒载体pVI75的构建使得疫苗株筛选的工作量大为降低,时间大大缩短,为利用痘苗病毒载体构建重组病毒疫苗株的研究提供了参考。
2004年04期 315-321页 [查看摘要][在线阅读][下载 120k] [下载次数：218 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：5 ] |[阅读次数：333 ] - 高东英,彭耿,朱家明,孙丽,郑英杰,张军
为了解献血员戊型肝炎感染情况,对2002年7～8月向北京市血液中心义务献血的所有人员进行整群抽样并抽血,应用ELISA检测戊型肝炎病毒(HEV)IgG的感染率。结果发现:北京献血员HEVIgG总感染率为26 59%,性别、年龄、省份分布存在着差别,男性比女性感染率高,年龄越大感染率越高,来自高感染省份者感染率也高,但ALT与HEVIgG感染无关。因此,男性、年龄大、来自高感染省份具有较高的HEV感染风险,进一步研究献血员的亚临床感染对HEV的输血安全性具有重要意义。
2004年04期 322-325页 [查看摘要][在线阅读][下载 46k] [下载次数：159 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：20 ] |[阅读次数：308 ] - 袁桂萍,程安春,汪铭书,周毅,刘菲,韩晓英,廖永洪,徐超,郭宇飞,周伟光,文明,贾仁勇,陈孝跃
应用透射电镜和超薄切片技术,研究鸭病毒性肠炎病毒(duckenteritisvirus,DEV)CH强毒株人工感染成年鸭后,病毒在宿主细胞内的形态发生及各组织器官的超微结构变化。结果表明,感染后不同时间剖杀及发病后死亡鸭的肝、肠、脾、胸腺、法氏囊等组织器官中,均观察到典型的疱疹病毒粒子。病毒主要的靶细胞为淋巴细胞、网状内皮细胞、成纤维细胞、巨噬细胞、血管内皮细胞、肠道上皮细胞、肠道平滑肌细胞和肝细胞等。DEV的核衣壳有空心型、致密核心型、双环型和内壁附有颗粒型四种形态,存在胞核和胞浆两种装配方式。病毒核衣壳可在核内获得皮层,通过核内膜获得囊膜成为成熟病毒;也可通过内外核膜进入胞浆,在其中获得皮层,然后在各种质膜上获得囊膜,最后成熟病毒释放到细胞外。伴随着病毒的复制、装配和成熟,细胞中出现多种核内和胞浆包涵体、核内致密病毒核酸颗粒、微管和中空短管以及胞浆内膜包裹的电子致密小体、双层管等病毒相关结构。超微研究表明,组织细胞有坏死和凋亡两种变化。坏死细胞肿胀甚至破裂,线粒体肿胀空泡化,粗面内质网扩张,核糖体脱落,有的细胞器甚至完全崩解,染色质或固缩或溶解。凋亡细胞则染色质聚集,胞浆凝聚深染,细胞膜上有大量空泡,并有凋亡小体形成。细胞坏死与凋亡往往同时存在,疾病发?
2004年04期 326-332页 [查看摘要][在线阅读][下载 216k] [下载次数：237 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：59 ] |[阅读次数：326 ] - 严维巍,崔治中,王永坤
将兔出血症病毒衣壳蛋白VP60基因插入杆状病毒转移载体pBLUEBAC4,获得重组转移载体pBLUEBAC4-VP60。在脂质体转染试剂介导下,将重组杆状病毒转移载体pBLUEBAC4-VP60与线性化的野生型杆状病毒基因组DNA共转染对数生长期的Sf9昆虫细胞,经过三轮蚀斑纯化后,获得了克隆化的重组杆状病毒pBLUE BAC4-VP60。以重组杆状病毒感染Sf9细胞后,收获细胞培养上清和细胞裂解液上清,SDS-PAGE电泳分析显示,重组病毒pBLUEBAC4-VP60表达一分子量各为60kD左右的特异性重组蛋白,并且该重组蛋白经Westernblot检测,皆可被兔抗RHDV高免血清所识别,表明VP60蛋白基因在重组杆状病毒感染的Sf9昆虫细胞中得到了表达,并且具有与天然VP60相似的抗原性。血凝试验表明,表达的重组蛋白具有血凝特性,可以凝集人"O"型红细胞,血凝价为213。同时,该血凝性可被抗RHDV的高免血清所抑制。经电镜观察,重组病毒表达的衣壳蛋白可以在没有其他任何成分存在的条件下,在昆虫细胞内也能自然聚合成不包裹核酸的、与天然RHDV病毒粒子在物理形态上类似的病毒样颗粒(VLPs)。在与兔抗RHDV高免血清37℃作用1h后,该病毒样颗粒于电镜下观察可出现凝集成团的现象,表明该VLPs与天然RHDV在抗原性上也极为相似。
2004年04期 333-337页 [查看摘要][在线阅读][下载 79k] [下载次数：224 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：18 ] |[阅读次数：376 ] - 张永光,吕建亮,王永录,方玉珍,蒋守田,张维德,刘湘涛,潘丽,刘力宽,裴仉福
利用RT-PCR法扩增了经不同宿主系(乳鼠、BHK21细胞、PK15细胞)连传不同代次的口蹄疫O/China/99毒株的3A和VP1基因,并进行了核苷酸和氨基酸序列分析。结果表明,该毒株经不同宿主系传至90代后,VP1基因未发生大的变异,主要抗原位点也较稳定;而非结构蛋白3A基因却在不同宿主和代次发生突变缺失;经BHK21细胞传代后未发生缺失;经PK15细胞传代,在70～90代之间在第254～313位出现缺失;经乳鼠传代,在60～70代之间在第265～300位发生缺失,并在以后的90代毒中仍在此位缺失。这与代表性猪源流行毒O/YUN/TAW/97和O/HKN/21/70的3A基因在第276～305位发生缺失有相同之处。
2004年04期 338-346页 [查看摘要][在线阅读][下载 359k] [下载次数：173 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：7 ] |[阅读次数：399 ] - 刘胜旺,刘玉芬,孔宪刚,邵昱昊
应用RT-PCR方法扩增了冠状病毒鸡传染性支气管炎中国分离毒株LX4的mRNA1ORF1,并将其进行了克隆、序列测定和分析。表明LX4mRNA1基因包含2个ORF,其中ORF1a由11916个核苷酸组成,编码一条3971个氨基酸残基组成的多肽。ORF1b由7950个核苷酸组成,编码2649个氨基酸残基组成的多肽。与美国Beaudette株对应的ORF1a核苷酸及推导的氨基酸序列同源性均为85%,与对应的ORF1b的同源性分别为89%和95%。二者ORF1a和ORF1b重叠区推测的"滑脱序列"(slipperysequence)核苷酸序列一致,"假结"(pseudoknot)基本结构相似。不同之处在于"假结"第2环中LX4的第7位为A,而Beaudette株在该位置为G。与Beaudette株比较,LX4ORF1a核苷酸变异最频繁的区域集中在第2656～3098位碱基处,且在该区域有60个碱基的插入,导致推导的氨基酸序列插入了20个氨基酸残基。LX4ORF1b序列缺失9个核苷酸,主要集中在第5168～5181位之间,导致对应的氨基酸缺失3个。但这些差异是否与病毒的生物学特性有关不明。
2004年04期 347-352页 [查看摘要][在线阅读][下载 71k] [下载次数：166 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：6 ] |[阅读次数：371 ] - 朱瑞良,崔治中,张纪元,赵静,孙淑红,丁家波
为了研究超强毒鸡传染性法氏囊病病毒(vvIBDV)的致病性及其VP2基因高变区的分子变化,以vvIBDVGX8/99株囊毒为研究对象,将该毒在SPF鸡胚连传10代后,再在鸡胚成纤维细胞(CEF)上连续盲传。该病毒在CEF上传至22代时开始引发CEF细胞病变,随之在96孔细胞培养板上用无限稀释法连续克隆2次后获得了4个病毒克隆,再将该4个病毒克隆分别连续回传3～5周龄SPF鸡10代。分别比较4个克隆毒及其回传SPF鸡后不同传代毒,对4～6周龄SPF鸡的致病性及VP2高变区氨基酸分子的变化,结果表明,4个克隆化毒的细胞培养毒对SPF鸡只有0～6 7%的致死率,不同克隆毒的SPF鸡传代毒对SPF鸡的致病性却都逐渐增强,但程度差异很大,其中克隆#5在回鸡1、5和10代后的致死率从0分别增加到10%、20%和27%;克隆#4从6 7%增加至13%、17%和23%;但克隆#1和#3的致病性变化相对较小。相对于原始囊毒及鸡胚毒,4个克隆化毒在测序的VP2高变区的约145个氨基酸中,有10个位点发生了相同的变异,变得与适应细胞的疫苗毒D78株基本一致,在回鸡传代导致对鸡毒力增强的过程中,这10个位点中大多数氨基酸不再变化,只有第253位和256位氨基酸从囊毒的Q和I变为细胞适应毒的H和V后,有些病毒克隆回鸡至第10代时又变为原囊毒的Q和I,这表明VP2高变区大多数氨基酸的变异可能与病毒的
2004年04期 353-358页 [查看摘要][在线阅读][下载 101k] [下载次数：124 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：12 ] |[阅读次数：313 ] - 姜国勇,杨仁崔
Tm-22基因编码一CC-NBS-LRR抗病蛋白,Tm-22植株的抗病毒反应表现为系统性坏死症状。试验结果表明,Tm-22基因转化体种胚下胚轴的伸长受到外源乙烯的抑制,乙烯的持续性刺激能够诱导H2O2的产生和氧离子自由基(ROS)的猝发,以及PR-1a基因mRNA的转录。可以初步认为Tm-22转化体的抗ToMV反应是一个与乙烯信号转导途径有关的反应。
2004年04期 359-363页 [查看摘要][在线阅读][下载 77k] [下载次数：287 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：10 ] |[阅读次数：214 ] - 程安春,汪铭书,刘菲,宋涌,袁桂萍,韩晓英,徐超,廖永洪,周伟光,文明,贾仁勇,陈孝跃
根据GenBank文献,应用Oligo6 0分析软件合成了用于扩增鸭瘟病毒(duckplaguevirus,DPV)EcoRⅠ765bp片段的1对引物,上游引物(P1)位于EcoRⅠ片段的246～266nt,下游引物(P2)位于EcoRⅠ片段的727～744nt,以DPVCHa株DNA为模板,筛选PCR最佳反应条件,建立了检测DPV的PCR方法。应用该方法对强毒株DPV鸭胚培养物和弱毒株的鸡胚培养物进行扩增,均可获得498bp的DNA片段。而对正常鸭(鸡)胚和鸡马立克氏病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、鸭病毒性肝炎病毒、多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌、鸭副伤寒沙门氏菌和鸭疫里默氏杆菌培养物进行检测,结果均呈阳性。扩增产物测序结果与文献报道一致,证明了PCR方法的特异性。对DPVCHa株鸡胚毒提取物DNA进行检测,其最低检出量为10fg。用病毒分离、Dot-ELISA和PCR三种方法分别检测1990～2002年期间送检的临床样品,对所获得的结果进行χ2分析,证明PCR检出率明显高于前2种方法。CHa株免疫雏鸭后对血液、心、肝、脾、肺、肾、十二指肠、直肠、法氏囊、胸腺、胰腺、延脑、大脑、小脑、舌头、肌肉、骨髓、食道共18种组织和粪便进行PCR检测,结果表明:①皮下接种4h后,心、肝、脾、肾、法氏囊、胸腺、胰腺、延脑、大脑和小脑为阳性,8h后18种组织和粪便均为阳性;②口服接种4h后舌头和食道为阳性,8h后,
2004年04期 364-370页 [查看摘要][在线阅读][下载 84k] [下载次数：572 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：106 ] |[阅读次数：325 ] - 张大鹏,王进,杨洁,华子春2004年04期 371-377页 [查看摘要][在线阅读][下载 256k] [下载次数：378 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：5 ] |[阅读次数：320 ]
- 刘华雷,周斌,郁斌,王永坤,陈溥言2004年04期 378-381页 [查看摘要][在线阅读][下载 51k] [下载次数：233 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：18 ] |[阅读次数：363 ]
- 陈贵海,周江宁,王明丽2004年04期 382-384页 [查看摘要][在线阅读][下载 38k] [下载次数：335 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：5 ] |[阅读次数：325 ]
- 吴健敏,涂长春,任兆钧2004年04期 385-388页 [查看摘要][在线阅读][下载 49k] [下载次数：719 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：16 ] |[阅读次数：319 ]
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