- 王涛,张全福,李川,刘琴芝,李建东,梁米芳,李德新
构建汉滩病毒76-118N蛋白及其分别从N-端和C-端缺失的共6个突变体,在大肠杆菌BL-21中进行表达,并对其中一些蛋白进行了纯化。通过Westernblot、酶联免疫吸附试验(ELISA)进行汉滩病毒N蛋白的抗原表位分析,N蛋白及6个缺失突变体都与组特异性抗体L13F3呈阳性反应,而缺失突变体与型特异性抗体AH30呈阴性反应。构建汉滩病毒76-118N蛋白及其6个缺失突变体的真核表达载体,并在COS-7细胞中进行表达。通过间接免疫荧光试验(IFA)进行汉滩病毒N蛋白的抗原表位分析,病人血清与真核表达的N蛋白及6个缺失突变体呈阳性反应。而仅有N蛋白及缺失N端1~30位氨基酸序列的NPN30与型特异性抗体AH30呈阳性反应。证实组特异性抗体L13F3结合的抗原表位位于N端1~30位氨基酸;而C端抗原表位对于型特异性抗体AH30与N蛋白的识别和结合具有重要意义,缺失N端100位氨基酸序列可能破坏羧基端构象型表位,也可以影响N蛋白与AH30的结合。
2005年03期 161-167页 [查看摘要][在线阅读][下载 111k] [下载次数：168 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：3 ] - 程绍辉,梁明华,李泽琳,张霆,张珑,马洪涛,刘哲伟,曾毅
结合严重急性呼吸综合征(SARS)病毒株序列信息分析和高通量测序技术,建立一种快速、简单地确定SARS病毒株并筛查SARS病毒突变位点和突变频率的方法。从感染人SARS病毒的Vero-6细胞中提取病毒RNA,反转录为cDNA后,PCR扩增目的基因片段,采用焦磷酸测序技术(PyrosequencingTechnology,PSQ)进行第2601、79199、4791、9838多个碱基突变位点测序和突变频率分析。通过测序分析多个可能出现突变的位点,确定了该病毒为北京流行株,同时发现第7919位碱基发生了A/G突变。PSQ技术对于高通量筛选研究病毒基因的突变和确定病毒株型别有着简单、快速、灵敏的特点。利用生物信息学分析核酸多态性,结合实验验证,可以确定SARS病毒流行株的特征,有利于对突发事件及早确定传染来源。
2005年03期 168-172页 [查看摘要][在线阅读][下载 85k] [下载次数：265 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：7 ] |[阅读次数：3 ] - 杨益良,梁国栋,付士红,何海怀,李晓宇,邓娟,苏乃伦,王力华,侯云德
报告了中国首次分离的辛德毕斯病毒XJ-160株的感染性全基因组cDNA克隆的构建与鉴定。利用RT-PCR方法获得覆盖病毒全长基因组的cDNA片段,以低拷贝质粒pBR322作为骨架,将基因组cDNA置于SP6RNA聚合酶启动子之后,基因组3′末端带有35个连续的A,通过DNA重组技术组装成病毒基因组全长cDNA克隆。该克隆可在大肠杆菌DH5α中稳定扩增。经体外转录,RNA转录体转染BHK-21细胞,细胞发生病变,恢复病毒滴度达到107~108PFU/ml。全基因组cDNA克隆构建过程中引入的沉默突变(8453位核苷酸由C变为T)产生XbaI酶切位点作为遗传标记,在子代恢复病毒的基因组中稳定存在。从细胞病变的特征、BHK-21细胞的空斑形态、病毒的抗原性、病毒在细胞中的生长动力学特征以及对乳鼠的致病性等方面比较,恢复病毒和亲本病毒XJ-160没有显著区别,提示获得了具有感染性的XJ-160病毒全长cDNA克隆。该病毒感染性全基因组cDNA克隆可以作为反向遗传学系统,为进一步研究病毒复制和致病机制,以及开发相应的载体表达系统提供分子生物学工具。
2005年03期 173-180页 [查看摘要][在线阅读][下载 119k] [下载次数：255 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：11 ] |[阅读次数：3 ] - 葛胜祥,郭清顺,李少伟,张军,夏宁邵
设计针对国内流行的戊型肝炎病毒(HEV)基因Ⅰ、Ⅳ型,在这两型序列的保守区域设计了一套RT-PCR引物———E引物,并将E引物与目前较常用的3对通用引物(Meng、ConORF1和ConORF2引物)比较了检测基因Ⅰ、Ⅳ型HEV的灵敏度。对基因Ⅰ型HEV,E引物能检出的稀释度为105,参考引物能检出的稀释度为102~104;对基因Ⅳ型HEV,E引物能检出的稀释度为102,参考引物能检出的稀释度为101~102。在17份HEV-IgM阳性血清中,E引物检出5份,检出率为29.4%;参考引物只能检出1份或2份,检出率最高为11.8%。E引物在33份HEV-IgM阳性的隐性感染血清中检出6份,阳性率18.2%;在79份HEV-IgM阳性的临床肝炎血清中检出36份,阳性率45.6%。以上结果初步表明,对于在国内流行的基因Ⅰ、Ⅳ型HEV,E引物的检测灵敏度要高于目前常用的通用引物。
2005年03期 181-187页 [查看摘要][在线阅读][下载 128k] [下载次数：684 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：79 ] |[阅读次数：4 ] - 唐桂霞,卢春
采用分子克隆技术构建含卡波济肉瘤相关疱疹病毒(Kaposi′ssarcoma-associatedherpesvirus,KSHV)转化基因K12和含胞嘧啶脱氨酶(CD)基因重组逆转录病毒表达质粒,分别命名为LZRS-K12和pLXSN-Fcy∷Fur。将LZRS-K12质粒转染NIH3T3细胞系,诱导细胞转化获得具有肿瘤细胞生物学特性的N/K12细胞,进一步将pLXSN-Fcy∷Fur质粒转染N/K12细胞,获得含CD基因的N/K12/FF细胞。加入5-氟胞嘧啶(5-FC)后,采用MTT法、流式细胞仪和免疫组化(IHC)等方法,分别检测细胞存活率、凋亡率及凋亡相关蛋白的表达。结果显示,N/K12/FF细胞在使用5-FC后存活率明显下降。流式细胞仪检测结果显示,5-FC作用后的N/K12/FF细胞的凋亡率与作用前相比增加了4.6%。与此同时,经5-FC作用后的N/K12和N/K12/FF细胞的生长周期发生了明显变化,均表现为G0-G1期细胞比率降低,S和G2-M期细胞比率增高。5-FC使得N/K12细胞的增殖主要阻滞在G2-M期,而N/K12/FF细胞的增殖主要阻滞在S期。IHC检测结果表明,N/K12细胞在5-FC使用前后Fas和Fas-L表达改变均不明显;而N/K12/FF细胞在5-FC使用后的Fas和Fas-L表达水平均明显高于5-FC使用前的水平。提示,CD/5-FC对KSHV肿瘤转化基因K12诱导NIH3T3转化细胞具有杀伤作用;凋亡有可能介导了部分杀伤过程;Fas和Fas-L有可能部分参与凋亡的诱导。
2005年03期 188-197页 [查看摘要][在线阅读][下载 203k] [下载次数：86 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：3 ] - 杨筱凤,陈宏伟,郑瑾,司履生,董小平,王一理
为预防高危型人乳头瘤病毒16型(HPV16)诱发宫颈癌,制备以减毒志贺氏杆菌为载体的HPV16预防疫苗,以期载体可介导机体产生粘膜免疫反应,达到预防HPV16感染的目的。为此构建了以HPV16L1为免疫原的减毒志贺氏杆菌苗,并初步鉴定候选疫苗的减毒特性和免疫效果。利用基于志贺氏杆菌virG/icsA基因的表达载体(pHS3199),将HPV16L1基因插入后构成pHS3199-hpv16L1质粒,电穿孔法将其转入减毒志贺氏杆菌sh42,经筛选获得重组减毒sh42-HPV16L1工程菌。用免疫印迹法检测HPV16L1蛋白表达,连续传代法确定其传代和目的蛋白表达的稳定性;豚鼠角膜巩膜炎症试验检测细菌的毒力和菌苗的免疫效果;小鼠红细胞凝集抑制试验检测免疫血清对病毒样颗粒(VLP)的中和活性。免疫印迹检测证实,重组菌株sh42-HPV16L1可稳定表达HPV16L1;豚鼠角膜巩膜炎症试验证实,该候选菌苗无致病性。减毒sh42-HPV16L1经结膜囊途径免疫豚鼠,可以产生特异性体液免疫应答,免疫动物体内的血清、肠道、阴道分泌物中抗HPV16L1VLPIgG、IgA含量显著高于对照组,并且sh42-HPV16L1免疫动物血清可明显抑制HPV16L1VLP引起的小鼠红细胞凝集。因而sh42-HPV16L1将是一种潜在的HPV16候选预防疫苗。
2005年03期 198-203页 [查看摘要][在线阅读][下载 93k] [下载次数：233 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：8 ] |[阅读次数：3 ] - 高凯,赵爱志,吴小兵,药力波,张英起,王军志
为研究腺相关病毒2型载体应用于类风湿性关节炎进行基因治疗的可行性,首先构建携带人肿瘤坏死因子Ⅱ型受体胞外区和人免疫球蛋白IgG1Fc段融合基因的重组2型腺相关病毒(rAAV2/hTNFR:Fc),并对其生物学活性进行研究。以RT-PCR分别从U937和人淋巴细胞总RNA中扩增人肿瘤坏死因子Ⅱ型受体胞外区和人免疫球蛋白IgG1Fc段基因,并以重叠延伸PCR的方法将二者融合后克隆入pSNAV1载体质粒进行重组病毒生产,在进行重组病毒理化分析后,以TNFα细胞毒中和试验来研究该重组病毒的生物学活性。结果显示:所构建的重组病毒rAAV2/hTNFR:Fc基因结构与预期一致;病毒在体外感染BHK-21细胞后,含TNFR:Fc融合蛋白的表达上清可以有效中和人、大鼠、小鼠TNFα对L929的细胞毒性。所研究构建的重组腺相关病毒可以用来作为阻断TNFα的手段,进行类风湿性关节炎的基因治疗研究。
2005年03期 204-209页 [查看摘要][在线阅读][下载 84k] [下载次数：194 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：3 ] - 张相民,辛伟,王世峰,李仁清,陆柔剑,王文玲,吕亦晨,阮力
为确定痘苗病毒密码子偏向性与基因表达的关系及其在痘苗病毒与宿主细胞相互作用过程中的作用,按痘苗病毒的优势密码子对HIV-1gag基因进行改造,并对合成基因与野生型HIV-1gag基因在痘苗病毒载体系统的表达水平进行了研究。结果显示:①各目的基因分别正向插入了痘苗病毒TK区7.5k启动子下游;②免疫荧光检测显示,改造前后的gag基因均能够很好地在痘苗病毒中表达;③Westernblot检测显示,在相同感染量时,改造后的gag基因具有更高的表达水平;④流式细胞术检测显示,密码子改造后的gag基因较野生型gag基因表达水平提高约17%。上述结果表明:按照痘苗病毒优势密码子进行外源基因改造,可作为提高外源基因在痘苗病毒中表达的策略,同时提示,密码子偏向性是痘苗病毒与宿主细胞相互作用的重要调控因素。
2005年03期 210-216页 [查看摘要][在线阅读][下载 99k] [下载次数：138 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：12 ] |[阅读次数：3 ] - 李琳琳,何雅晴,朱俊萍,薛颖,朱雅芳,徐星晔,金奇
对分离自2000年中国深圳地区手足口病患儿粪便标本的柯萨奇病毒A组16型(CoxsackievirusA16,Cox.A16)病毒SHZH00-1株进行全基因组序列测定及分析后发现,Cox.A16SHZH00-1的基因组(未包括多聚腺苷酸尾)长度为7410bp,其中5′端非编码区(5′UTR)长为745bp,病毒基因组编码区全长6582个核苷酸,编码一个含2193个氨基酸残基的多聚蛋白,3′端非编码区长为83bp。Cox.A16SHZH00-1基因组的结构与Cox.A16亚洲地方株Tainan-5079-98(AF177911)十分相近,整个基因组的核苷酸同源性为97.5%,氨基酸同源性为98.8%;而与Cox.A16国际标准株G10(U05876)差别较大,两者核苷酸同源性仅为79.1%,氨基酸同源性为94.5%。Cox.A16SHZH00-1与两株肠道病毒71型SHZH03(AY465356)和BrCr(U22521)比较,核苷酸同源性均不超过80%。
2005年03期 217-222页 [查看摘要][在线阅读][下载 73k] [下载次数：823 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：75 ] |[阅读次数：3 ] - 2005年03期 222页 [查看摘要][在线阅读][下载 10k] [下载次数：22 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：3 ]
- 卫灿东,李琳琳,何雅晴,徐星晔,薛颖,金奇
利用1999~2004年连续6年从中国深圳及北京地区分离的柯萨奇病毒A组16型(CoxsackievirusA16,Cox.A16)毒株的部分VP1区基因序列进行分析和研究,试图找出中国Cox.A16的种系进化规律和分型依据。6株Cox.A16病毒部分VP1区核苷酸和氨基酸同源性均较高,相互间核苷酸同源性为94.5%~98.0%,氨基酸同源性为97.8%~100%。6株中国分离株与Cox.A16国际参考株相比,部分VP1区核苷酸同源性高于78.2%,氨基酸同源性高于为93.3%。基因系统进化分析表明,中国大陆分离的6株Cox.A16与中国台湾流行株Tainan-5079-98(AF177911),与4株日本分离株、瑞典株及美国株GA95-2095(AF081613)、PA94-5753(AF081628)的关系均较近,核苷酸同源性大于93.3%。了解我国Cox.A16流行株的遗传学背景和种系进化关系,对有效地预防和控制Cox.A16流行有重要意义。
2005年03期 223-227页 [查看摘要][在线阅读][下载 55k] [下载次数：416 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：26 ] |[阅读次数：3 ] - 郭慧琛,刘在新,孙世琪,冷青文,刘湘涛,谢庆阁
PCR扩增获得包含口蹄疫病毒P1、2A、3C、3D及部分2B编码区的目的基因片段P12X3C3D,将P12X3C3D经AflⅡ和XbaI双酶切后,定向克隆于真核表达质粒载体pcDNA3.1(+);另将PCR扩增获得的P12X3C3D直接与真核表达质粒载体pTARGETTM连接,进行筛选、鉴定及DNA序列分析,分别获得重组质粒pcDNA3.1/P12X3C3D、pTARGET/P12X3C3D。将重组质粒分别转染BHK-21细胞,通过双抗体夹心ELISA方法和间接免疫荧光标记方法检测细胞中表达的口蹄疫病毒抗原,用磷钨酸负染,以电子显微镜观察转染重组质粒的细胞中组装的口蹄疫病毒空衣壳。结果表明,口蹄疫病毒基因组片段正确克隆到真核表达质粒载体上,重组质粒pcDNA3.1/P12X3C3D、pTARGET/P12X3C3D均可在BHK-21细胞中表达FMDV目的蛋白。其中重组质粒pTARGET/P12X3C3D表达的口蹄疫病毒抗原蛋白,能够在细胞内正确组装成病毒空衣壳。
2005年03期 228-234页 [查看摘要][在线阅读][下载 117k] [下载次数：414 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：12 ] |[阅读次数：3 ] - 左建民,周玲,杜海军,付华,王琦,曾毅2005年03期 235-237页 [查看摘要][在线阅读][下载 37k] [下载次数：175 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：3 ]
- 徐烟青,周永东,毕胜利2005年03期 238-241页 [查看摘要][在线阅读][下载 57k] [下载次数：241 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：12 ] |[阅读次数：3 ]
- 2005年03期 242页 [查看摘要][在线阅读][下载 10k] [下载次数：27 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：3 ]
下载本期数据