- 邢江峰;朱汝南;钱渊;赵林清;邓洁;王芳;孙宇;
为了解北京地区新近发现的新型冠状病毒-人冠状病毒NL63(Human coronavirus NL63,HCoV-NL63)的N和E蛋白编码基因的特征,从经RT-PCR检测阳性的临床标本中扩增得到的HCoV-NL63 N蛋白和E蛋白编码基因序列,分别克隆至pCF-T和pUCm-T载体中并进行测序,同时运用生物信息学的方法,对北京HCoV-NL63阳性标本BJ8081 N和E蛋白编码基因的核苷酸和氨基酸序列与HCoV-NL63原型株及其他几种冠状病毒的N和E蛋白编码基因的核苷酸和氨基酸序列进行比较分析和种系进化分析;用SOPMA方法对BJ8081 N和E蛋白的二级结构进行了预测分析,并对N和E蛋白的其他生物学特性进行了预测分析。经序列比对分析发现,BJ8081 N蛋白氨基酸序列在78~85肽段(FYYLGTGP)内与所比较的其他冠状病毒N蛋白相应位置的氨基酸序列完全相同,提示此区段可能为包括HCoV-NL63在内的所有冠状病毒N蛋白的保守区域。在BJ8081 N蛋白氨基酸序列的100~121肽段可能是和基因组RNA相结合的位置;在BJ8081 E蛋白的15~37位氨基酸可能是E蛋白的跨膜区域。研究对BJ8081 N蛋白和E蛋白的编码基因序列进行了测定和生物信息学分析,为今后对HCoV-NL63的进一步深入研究奠定了基础。
2007年04期 245-251页 [查看摘要][在线阅读][下载 1370K] [下载次数：557 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：3 ] - 袁权;葛胜祥;闫强;赵昱;熊君辉;张军;夏宁邵;
本研究以与血清中HBV DNA含量高度相关的两种HBV抗原(前S1抗原与核心抗原)为靶标,建立了联合检测这两种HBV核酸相关抗原(NRAg)的双抗体夹心法ELISA试剂。对系列稀释血清的检测表明,该试剂的平均分析灵敏度为103.2基因组拷贝/mL(95%可信限102.2-4.2基因组拷贝/mL),显著高于前S1抗原或核心抗原的单独检测。对994份HBsAg阴性血清的检测结果表明NRAg ELISA的特异性为99.7%(95%可信限:99.1%~99.9%)。对271份临床慢性肝炎血清进行检测,结果NRAg ELISA与HBV DNA结果的总符合率达96.3%(95%可信限:93.3%~98.2%),NRAg ELISA的读值/临界值比(S/CO)与HBV基因组拷贝数呈正相关。利用NRAg试剂,发现了1例HBsAg"a"抗原表位突变的变异株。这些结果显示HBV NRAg ELISA与HBV DNA具有高度相关性,并能够检测出HBsAg抗原变异株,有望成为HBsAg变异株筛选的有力工具,并为广大基层医疗单位提供一种便捷的替代HBV DNA定性检测的手段。
2007年04期 252-257页 [查看摘要][在线阅读][下载 283K] [下载次数：227 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：14 ] |[阅读次数：3 ] - 韩炳娟;郭丽;屈建国;王敏;王健伟;鲁茁壮;洪涛;
人F组腺病毒Ad40、Ad41难以在体外培养的细胞中传代,被称为难养腺病毒(Fastidious adenovirus)。本研究观察了在Hep2细胞表达Ad41 E1B55K基因对Ad41复制的促进作用。从Ad41阳性粪便标本中用PCR的方法获得E1B55K基因,构建真核表达载体,转染Hep2细胞,筛选单克隆,用RT-PCR检测了E1B55K基因的表达。用引起293细胞完全CPE比较产毒量的方法对所得细胞克隆进行初步筛选,获得一株产毒相对较强的细胞Hep2-E1B#4。与对照细胞Hep2、Hep2-DNA3相比,等量Ad41接种Hep2-E1B#4产生的细胞病变效应(CPE)程度明显加深。用免疫细胞化学的方法测定产毒的感染滴度,等量Ad41接种后,Hep2-E1B#4产生的子代腺病毒滴度大于对照的9倍;半定量PCR测得Hep2-E1B#4子代病毒基因组拷贝数约为对照细胞的4倍。结果说明转染E1B55K基因促进了Ad41在Hep2细胞的复制,获得的Hep2-E1B#4细胞株可用于Ad41的分离、培养和体外扩增。
2007年04期 258-264页 [查看摘要][在线阅读][下载 399K] [下载次数：127 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：3 ] - 李萍;韩俊;单冰;雷艳君;周伟;姜慧英;董小平;
Doppel(Dpl)蛋白是新近发现的PrP相关蛋白。根据GenBank公布的人PRNDcDNA序列设计合成特异性引物,用PCR方法从人外周血白细胞总DNA中扩增获得531 bp的人PRND完整基因序列,测序正确后克隆至表达载体,转化大肠杆菌JM109,IPTG诱导表达重组人Doppel(rhDpl)蛋白。目的蛋白以包涵体形式表达,表达量占菌体总蛋白的60%以上。表达产物用Ni2+亲和层析柱纯化及羟胺化学裂解法去除标签蛋白,SDS-PAGE检测证实,纯化的rhDpl蛋白相对分子量约为15 kD。Trypan Blue及MTT实验显示,在50μg/mL及以上剂量时,rhDpl蛋白具有抑制人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞生长的作用,在100μg/mL及以上剂量时,rhDpl具有杀伤HeLa细胞的活性,呈现明显的剂量和时间依赖性。Hoechst33342荧光染色观察显示经rhDpl作用的人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y呈现出细胞凋亡现象。这些结果提示Dpl蛋白具有体外细胞毒作用,并呈现明显的组织类型特异性。以上工作为进一步了解人Dpl蛋白体内外生物学作用奠定了基础。
2007年04期 265-269页 [查看摘要][在线阅读][下载 295K] [下载次数：108 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：3 ] - 翟友刚;王焕琴;付士红;梁国栋;
对我国海南省和河北省分离到的3株盖塔病毒(GETV)(M1、HB0215-3和HB0234)进行衣壳蛋白基因和3′UTR区序列测定,并分析比较该病毒的分子生物学遗传特征。首先应用逆转录聚合酶链反应扩增出病毒衣壳蛋白基因和3′UTR片段,纯化后连接到载体中进行测序,然后用Clastal X和DNASTAR软件对测定的核苷酸和推测的氨基酸序列进行比较分析,用MEGA软件绘制系统发生树。3株病毒衣壳蛋白基因分别由801、804和804个核苷酸组成,分别编码267、268和268个氨基酸,3株病毒之间核苷酸和氨基酸序列同源性为97.6%~100%和97.8%~100%,与其他GETV分离株核苷酸同源性在95.4%~99.6%之间。3株病毒3′UTR分别由411、401和401个核苷酸组成,发现中国株存在10个(45~54位)核苷酸缺失和2个(64位、148位)特有的核苷酸位点。进化分析表明盖塔病毒之间的进化关系与分离年代相关,中国境内流行的盖塔病毒是相对独立的一个类群。
2007年04期 270-275页 [查看摘要][在线阅读][下载 479K] [下载次数：304 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：23 ] |[阅读次数：3 ] - 姚海兰;肖宗慧;任红雁;韩继生;刘哲伟;
为了研究短双链RNA(Small interfering RNA,siRNA)对柯萨奇B组3型病毒(CVB3)复制的影响及其作用特性,合成针对CVB3基因组2B区的siRNA-2B,脂质体法转染HeLa细胞后感染CVB3病毒,观测转染效率及存留时间、毒性作用、病毒致细胞病变效应、病毒滴度、病毒RNA含量、siRNA-2B对重组基因的特异性降解及培养上清有限稀释后再感染情况。结果发现siRNA-2B能高效转染入HeLa细胞并存留长达48h,高剂量的siRNA-2B对培养细胞无明显毒性,siRNA-2B能特异性针对2B区有效地降解病毒RNA,能明显抑制病毒RNA的复制。随着转染浓度的增加,siRNA-2B的抗病毒作用逐渐增强。siRNA-2B还能明显降低CVB3的再感染能力。这些结果提示,针对基因组2B区的siRNA-2B可以明显抑制CVB3基因复制,有效控制病毒再感染,并具有高效性、特异性和量效关系等特点。为siRNA可能成为预防和治疗CVB3感染的新途径奠定基础。
2007年04期 276-281页 [查看摘要][在线阅读][下载 401K] [下载次数：125 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：4 ] |[阅读次数：3 ] - 赵维波;黄韧;张钰;闵凡贵;王静;刘香梅;刘忠华;
对恒河猴进行二次接种H5N1亚型禽流感病毒试验,并对二次接毒的结果进行观察,评估初次接毒对恒河猴二次接毒效果的影响。首次接种试验中,3、4、5号恒河猴用环甲膜穿刺注射方法接种含有H5N1亚型禽流感病毒的尿囊液,6号猴接种不含病毒的尿囊液。90d后,再次用环甲膜穿刺注射方法二次接种,4、5、6号猴接种7mlTCID50浓度为104.875病毒的尿囊液,3号猴接种7ml不含病毒的尿囊液。进行抗体等检测,并分别于72h无痛处死3、4、6号猴,第7d无痛处死5号猴,进行肺的病毒检测及病理观察。结果显示,3、4、5号猴至试验结束时体内依然有较高的抗H5N1亚型禽流感病毒抗体水平,6号猴没有抗体;通过RT-PCR以及免疫组化染色进行病毒检测,均只在6号猴肺部检出病毒,且6号猴肺部病理损伤最为严重。由此可以得出初步结论:在初次感染H5N1亚型禽流感病毒后90d,临床症状已基本恢复正常的恒河猴体内仍然有较高水平的抗体,此时,恒河猴抵抗H5N1亚型禽流感病毒二次感染的能力显著提高。
2007年04期 282-286页 [查看摘要][在线阅读][下载 427K] [下载次数：103 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：3 ] - 胡森;王清华;王喜军;王笑梅;步志高;
对牛痘病毒弱毒株表达的SARS冠状病毒纤突蛋白(Spike protein,S)的免疫原性进行分析与比较。以减毒痘病毒(WR株)为载体重组了SARS冠状病毒全长S基因(rWR-SARS-S)。SDS-PAGE和Western blot试验表明,迁移率约为190kD的重组SARS S蛋白可在HeLa细胞中表达,而且可以被鸡抗SARS全病毒高免血清识别,具有特异免疫反应原性。进一步研究表明,rWR-SARS-S感染的细胞在IFA试验中可与鸡抗SARS的高免血清发生特异反应,具有良好的敏感性和特异性。以104PFU的rWR-SARS-S免疫BALB/c小鼠产生的抗体在间接ELISA试验中可以被S蛋白识别,产生特异抗原抗体反应。利用痘病毒表达的SARS冠状病毒S蛋白具有良好的抗原性和生物学活性,可替代SARS冠状病毒全病毒,为研究安全、敏感和特异的重组诊断抗原奠定了重要基础。
2007年04期 287-291页 [查看摘要][在线阅读][下载 295K] [下载次数：182 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：4 ] - 王安平;孙怀昌;王建业;王永娟;袁维峰;
为了开展重组禽腺联病毒(Recombinant avian adeno-associated virus,rAAAV)介导的基因转移研究,用限制性内切酶消化含AAAV全基因组的重组质粒pCR-AAAV,去除AAAV Rep和Cap蛋白编码序列,将PCR扩增的绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)报告基因插入AAAV末端反向重复序列(Inverted terminal re-peats,ITR)之间,获得表达GFP基因的AAAV转移载体pAITR-GFP;以含AAAV全基因组的质粒为模板,用PCR分别扩增AAAV Rep、Cap和Rep-Cap蛋白基因,将Rep和Cap基因分别插入真核细胞双表达载体pVITRO2-mcs的两个多克隆位点,将Rep-Cap蛋白基因插入真核细胞表达载体pcDNA3,获得AAAV辅助质粒pVITRO2-ARC和pcDNA-ARC;将pAITR-GFP、pVITRO2-ARC或pcDNA-ARC与腺病毒辅助质粒pHelper组成三质粒转染系统,用磷酸钙沉淀法共转染AAV-293细胞,获得了表达GFP的rAAAV。经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后,纯化病毒出现分子量正确的VP1、VP2、VP3结构蛋白;经PCR检测证明,重组病毒中含有GFP报告基因;用重组病毒分别感染鸡胚成纤维细胞(CEF)和鸡胚肝CEL细胞,可以观察到GFP报告基因的表达,表达时间持续两周以上。这些试验结果表明,成功建立了辅助病毒非依赖性rAAAV体外包装体系,为禽源细胞的基因转移研究和禽重组活载体疫苗的研制打下了基础。
2007年04期 292-297页 [查看摘要][在线阅读][下载 286K] [下载次数：317 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：10 ] |[阅读次数：3 ] - 聂磊;张庆霞;韩宗玺;邵昱昊;荣骏弓;刘胜旺;孔宪刚;
应用RT-PCR方法扩增到了我国1995~2004年20株IBV现地分离株的膜蛋白(Membrane,M)基因片段。序列测定表明,20株IBV分离株M基因开放阅读框由672~681bp组成,编码由223~226个氨基酸残基组成的多肽。与我国分离株LX4相比,M基因推导氨基酸序列的变异主要发生在2~17位、221~223位,其中4~6位存在氨基酸的插入和缺失,导致IBV毒株间M蛋白糖基化位点的差异。与GenBank中34株IBV参考毒株M蛋白基因推导氨基酸序列进行比较和分析,系统进化关系显示54株IBV毒株分属于5个进化群。我国IBV分离株M基因在进化关系上较为独立,主要分布在第Ⅱ群和第Ⅳ群,其中第Ⅱ群分离株和中国台湾毒株进化关系密切。此外,参考IBV国内分离株S1基因及N基因系统发育进化树的研究结果,并与M基因进行比较,表明我国IBV也存在着基因重组现象,尤其是疫苗毒和流行毒之间的重组。
2007年04期 298-304页 [查看摘要][在线阅读][下载 369K] [下载次数：204 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：27 ] |[阅读次数：3 ] - 邓小芸;高玉龙;高宏雷;祁小乐;王晓艳;王笑梅;
利用肽扫描技术对4株IBDV VP3的单克隆抗体(HRB-3F、HRB-7B、HRB-7C和HRB-10E)的抗原表位进行了研究。通过Western blot和ELISA鉴定,将HRB-3F和HRB-7B的抗原表位定位于VP3 109~119aa(位于IB-DV聚合蛋白的864~874aa),HRB-7C和HRB-10E的抗原表位定位于VP3 177~190aa(位于IBDV聚合蛋白的932~945aa)。进一步检测其反应原性及免疫原性,结果表明,这两个表位均能与抗IBDV阳性血清反应。将这两个表位短肽免疫BALB/c小鼠,其血清可以和IBDV反应,具有较好的免疫原性。与D6948、HK46和UK661等多株IBDV相应区域的同源性进行了比较,结果显示,这两个表位在多种毒株中同源性为100%。通过IBDV VP3抗原表位的研究,筛出两个新的保守线性表位并进行精确定位,对进一步分析IBDV结构与功能以及建立以表位为基础的抗原抗体诊断方法具有重要的意义。
2007年04期 305-311页 [查看摘要][在线阅读][下载 738K] [下载次数：306 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：13 ] |[阅读次数：3 ] - 丁春宇;张大丙;
用3′RACE和RT-PCR扩增并克隆鸭肝炎病毒(Duck hepatitis virus,DHV)Ⅰ型毒株C80和Ⅰ型变异株E63的3′末端序列。分析结果显示,C80株和E63株基因组3′末端均包含1 359 nt的3D、终止密码子TGA、长314nt的3′UTR,而poly(A)尾分别含18个A和19个A。由2株DHV 3D核苷酸序列所推导的3D蛋白均含453个氨基酸,均包含KDELR、DxxxxD、GxxCSGxxxTxxxNS、YGDD和FLKR等小RNA病毒RNA聚合酶的特征基序,该结果进一步证实Ⅰ型DHV属于小RNA病毒科的成员。两株DHV与小RNA病毒科9个已知属之间3D蛋白的氨基酸序列同源性为16%~37%,介于属间3D蛋白的氨基酸序列同源性范围(18%~60%)之内;此外,Ⅰ型DHV的3′UTR在小RNA病毒科是最长的。用3D蛋白进行进化分析的结果表明,Ⅰ型DHV可能属于小RNA病毒科的一个独立的病毒属。
2007年04期 312-319页 [查看摘要][在线阅读][下载 933K] [下载次数：365 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：28 ] |[阅读次数：3 ] - 唐丽华;张全福;修梅红;扈光伟;沈博;杨显达;梁米芳;李德新;
对我国东北地区捕获的157份棕背鼠平的肺组织进行普马拉病毒检测。其中免疫荧光检测出阳性标本1份,PCR检测出核苷酸阳性标本7份。对PCR产物进行测序后发现,其核苷酸的序列与报道的普马拉病毒核苷酸序列存在着差异。系统进化分析表明,我国发现的这株普马拉病毒,在进化树上形成了一个新的分支,为一新亚型。并且与在韩国和日本发现的普马拉病毒亲缘关系最为接近。
2007年04期 320-325页 [查看摘要][在线阅读][下载 435K] [下载次数：131 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：12 ] |[阅读次数：3 ] - 修梅红;王芹;唐丽华;曹守春;李伟红;韦燕;陆鹏;梁米芳;李德新;
构建稳定表达T7RNA聚合酶的细胞系,用于提高拯救麻疹病毒微复制子效率。PCR扩增T7RNA聚合酶基因,克隆到真核表达载体,转染Vero细胞,用G418筛选到稳定表达的细胞株Vero/pcDNA3-T7。用Westernblotting证明了T7RNA聚合酶在细胞中的表达。将T7启动子控制绿色荧光蛋白表达的质粒转染该细胞后,绿色荧光蛋白在细胞株中得到表达。反向插入报告基因的微复制子转染感染麻疹病毒的Vero/pcDNA3-T7细胞后,细胞中能够检测到报告基因的表达。用细胞系取代痘苗病毒系统,可以提高拯救效率。
2007年04期 326-330页 [查看摘要][在线阅读][下载 236K] [下载次数：434 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：8 ] |[阅读次数：3 ]