- 孙丽娜;刘琴芝;王敏;李川;李梓;胡晓芬;朱莉莉;李群;王世文;舒跃龙;梁米芳;李德新;
运用噬菌体表面呈现技术,从禽流感病人恢复期血中获得淋巴细胞,通过基因工程手段,构建了人源抗H5N1禽流感病毒基因工程抗体文库。用纯化的人源H5N1禽流感病毒颗粒(A/Anhui/1/2005)及重组血凝素蛋白HA(A/VietNam/1203/2004)对Fab噬菌体抗体库进行富集筛选,成功地获得了抗禽流感病毒H5N1血凝素蛋白HA的人源单抗Fab段基因,并在大肠杆菌中获得有效表达。通过序列测定确定抗体轻重链型别,然后将阳性克隆的轻链和重链Fd段基因分别克隆入全抗体表达载体pAC-L-Fc后转染昆虫Sf9细胞,利用杆状病毒/昆虫细胞系统实现全抗体的分泌型表达。用ELISA、IFA和流式细胞术对所获人源单抗的功能特性进行鉴定。结果表明,我们获得了2株特异性针对H5N1禽流感病毒血凝素蛋白HA而与甲1型和甲3型人流感病毒无交叉反应的人源单抗(AVFluIgG01、AVFluIgG03)。微量中和试验结果表明,除A/Guangdong/1/2006外,AVFlu-IgG01能够广泛地中和HA基因进化上属于Clade2的中国南方、北方及中部地区的H5N1禽流感病毒分离株,同时还对属于CladeⅠ的越南H5N1分离株A/VietNam/1203/2004具有中和活性;AVFluIgG03虽然不能中和A/VietNam/1203/2004,但是对属于Clade2的所有中国H5N1分离株均具有中和作用。人源中和性抗禽流感病毒H5N1基因工程全抗体的获得不仅为高致病性禽流感病毒H5N1的预防和治疗带来了希望,同时也为其疫苗研制提供了新的思路。
2008年03期 165-171页 [查看摘要][在线阅读][下载 751K] [下载次数：343 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：3 ] |[阅读次数：1037 ] - 朱莉莉;李川;李建东;孙丽娜;梁米芳;李德新;
抗体重链可变区框架I区(FR-I)对抗体在原核细胞中的分泌表达具有显著的影响,单个氨基酸的改变即可导致抗体分子分泌能力的丧失。为了探索抗体在哺乳动物细胞中的高效表达,我们对一株不能有效分泌的人源抗狂犬病病毒抗体pCMV-RV/VH的FR-I区氨基酸编码基因进行定点突变研究。实验显示,抗体重链可变区FR-I区H6位的氨基酸由Glu突变为Gln之后,抗体的分泌表达水平得到了显著的提高,并且与抗原特异性结合的能力也明显增强。通过免疫荧光法对抗体在细胞内的转运过程进行了初步的探讨,发现能够有效分泌的抗体与无分泌表达的抗体都能够在细胞内进行正常的转录和翻译,进入内质网并转运至高尔基体,而且胞内表达水平基本一致。我们认为分泌能力的不同可能是FR-I区影响抗体分子的折叠与装配所致,其中该区H6位氨基酸的性质能够显著影响抗体在哺乳动物细胞中的分泌。本研究以抗体重链可变区FR-I区氨基酸为焦点,对基因工程抗体在真核细胞中高效表达的影响因素进行了探索,为改进抗体规模化生产提供了依据。
2008年03期 172-177页 [查看摘要][在线阅读][下载 555K] [下载次数：159 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：6 ] |[阅读次数：422 ] - 李启明;马学军;高寒春;周蕊;匡治州;侯云德;
建立一种便捷、灵敏的检测方法,即逆转录环介导等温核酸扩增技术(RT-LAMP)用于H5N1亚型禽流感病毒基因检测。该技术使用特异对应于靶序列中8个基因区段的6条特异引物,在等温条件下进行核酸扩增反应。对51份实验感染动物及病毒培养标本的H5N1亚型禽流感病毒的HA、NA基因区进行了RT-LAMP检测,并以SYBR Green I为反应指示剂进行了逆转录环介导等温核酸扩增技术,对该反应进行实时监控,经对扩增产物做内切酶验证和测序分析,证明RT-LAMP技术的特异性;同时,用10倍系列稀释的RNA样品对该检测方法的灵敏度进行了测试。结果显示:利用RT-LAMP技术成功检测到H5N1禽流感病毒的HA、NA基因区,且RT-LAMP与Real-time PCR结果呈现很好的一致性。此方法的灵敏度可达到能检测10个拷贝RNA分子水平。因此,RT-LAMP技术应用于H5N1亚型禽流感病毒的快速检测是一种可行的方法。
2008年03期 178-184页 [查看摘要][在线阅读][下载 711K] [下载次数：1640 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：87 ] |[阅读次数：944 ] - 董辰方;黄银霞;安润;陈建明;王小凡;单冰;雷艳君;韩露;张宝云;韩俊;董小平;
建立一种新的基于链霉素沉淀的PrPSc的Western blot检测方法,用终浓度为60mmol/L的链霉素处理蛋白酶K消化的PrPSc贮存液,通过离心沉淀PrPSc,用Western blot对PrPSc的链霉素富集效果进行检测。结果显示,链霉素能够与PrPSc结合形成高分子量复合物,但不影响糖基化形式。此外,基于链霉素沉淀的Western blot,无论是在低浓度或是大容积的条件下,均可显著地提高对PrPSc检测的敏感性。基于链霉素沉淀的Western blot试验是一种敏感、特异、快速及灵活的检测方法,有潜力用于脑组织、外周组织及体液中低水平的PrPSc的检测。
2008年03期 185-189页 [查看摘要][在线阅读][下载 449K] [下载次数：89 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：369 ] - 冯霞;余双庆;刘红梅;刘新蕾;王小利;周玲;曾毅;
从河南HIV-1流行区感染者中克隆HIV-1 B亚型gag基因,通过序列比对获得其一致性共有序列,对该共有序列按照哺乳动物优势密码子的使用原则进行优化,以Western blot方法比较优化前后gag基因体外表达量。发现对gag基因进行密码子优化可显著提高其表达水平。将优化后的mod.gag基因插入重组腺病毒载体,构建了重组病毒rAdV-mod.gag。在BALB/c小鼠体内分别以108PFU及109PFUr AdV-mod.gag疫苗单独免疫两次均可产生较高水平的gag特异性细胞免疫反应。由此得出结论,对gag基因的密码子优化是成功的;表达优化后gag基因的重组腺病毒疫苗,可以在小鼠体内诱导较强的gag基因特异性CTL应答。
2008年03期 190-195页 [查看摘要][在线阅读][下载 471K] [下载次数：227 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：9 ] |[阅读次数：455 ] - 吴雪伶;聂建辉;张春涛;吴瑜;赵晨燕;王佑春;
为了检测HPV58型不同L1基因的DNA疫苗的免疫原性,以pcDNA3.1为载体分别构建含HPV58型不同L1基因的DNA疫苗,命名为L1h、L1h△c、L1S、L1SM和L1wt。用免疫印迹法检测各DNA疫苗的体外表达情况;各重组质粒与pcDNA3.1-h58L2和pcDNA3.1-GFP共转染293FT细胞,检测其形成假病毒的能力;并将各DNA疫苗肌肉注射免疫小鼠,利用假病毒中和实验检测中和抗体水平,用ELISPOT检测细胞免疫情况。结果显示,本实验成功构建了五种DNA疫苗,L1h△c的体外表达量最高,L1S和L1SM的表达量次之,L1wt没有表达;重组质粒L1S能够形成假病毒,而其他四种重组质粒均不能形成假病毒。L1S和L1h均可在小鼠体内诱导中和抗体,但L1S诱导的中和抗体的平均滴度为1:6400,明显高于L1h诱导的中和抗体水平(平均滴度为1:48),而其他疫苗在小鼠体内未产生中和抗体。对五种疫苗均未检测出特异性的细胞免疫反应。结果提示,体外能够组装成假病毒的DNA疫苗在免疫动物后可诱导高滴度的中和抗体,为今后DNA疫苗的筛选提供参考。
2008年03期 196-201页 [查看摘要][在线阅读][下载 465K] [下载次数：264 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：4 ] |[阅读次数：355 ] - 陈露菲;刘彦成;陈淑红;惠珊;李冀宏;许军;
为了解分离自黑龙江省大兴安岭林区全沟硬蜱中的DXAL-5、12、13、16、18、21共6株森林脑炎(TBE)病毒E蛋白基因特征并确定病毒基因型,应用RT-PCR技术对6株病毒E蛋白基因进行体外扩增、克隆、测序。结果发现,6株病毒E蛋白基因的核苷酸序列长均为1488bp,推导的氨基酸序列长均为496aa。与TBE参考毒株E蛋白基因进行比较,这6株病毒与远东亚型同源性最高,其次是西伯利亚亚型,与欧洲亚型同源性最差;在决定亚型特征的氨基酸位点多数属于TBE病毒远东亚型。E蛋白基因推导的氨基酸种系发生树分析表明,6株病毒均在远东亚型分枝内。因此就E蛋白基因而言,DXAL-5、12、13、16、18、21株均属于TBE病毒的远东亚型。新分离毒株与Senzhang株同源性较高,种系发生关系也比较接近,推测疫苗株对新分离毒株仍具有很好的保护作用。但是在E蛋白的A、B和C抗原决定区内,6株病毒均有不同程度的氨基酸改变,这些突变有可能影响E蛋白的功能。
2008年03期 202-207页 [查看摘要][在线阅读][下载 330K] [下载次数：316 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：13 ] |[阅读次数：313 ] - 李怡璇;刘民;李欣;汤华;
格尔德霉素(Geldanamycin,GA)作为一种苯醌安莎霉素类抗生素,能与热休克蛋白90特异性结合,具有广谱的抗病毒作用。为了从转录水平上研究GA抗病毒的分子机制,本研究以单纯疱疹病毒I型(Herpes simplex virus type1,HSV-1)为对象,在确定药物有效抗病毒作用的基础上,采用基因芯片技术分析了在HeLa细胞中病毒感染和药物处理对细胞表达谱的影响,并筛选出GA抗病毒作用的可能相关基因。同时用半定量RT-PCR方法对GA诱导上调、HSV-1诱导下调的基因(ACTG1、RAN、SOD1)以及GA诱导下调、HSV-1诱导上调的基因(HYAL1)进行了验证。研究GA抗病毒作用对细胞表达谱的影响,有利于深入理解药物的抗病毒机制。
2008年03期 208-212页 [查看摘要][在线阅读][下载 252K] [下载次数：169 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：5 ] |[阅读次数：282 ] - 张娜;程安春;汪铭书;李传锋;陈孝跃;
通过光镜、电镜、DNA Ladder法、流式细胞术、荧光染色对鸭呼肠孤病毒(DRV)诱导鸭胚原代成纤维细胞(DEF)凋亡情况进行检测。结果显示,光镜可见细胞形态学上出现细胞皱缩,染色质浓染边移;电镜观察到细胞胞浆浓缩,细胞核染色质凝聚、部分形成凋亡小体;荧光染色结果显示,在感染后24h有激发绿色荧光的凋亡细胞出现,随着时间的推移,激发红色荧光的死亡细胞数量增多;DNA Ladder检测到感染后24~144h的DNA样品呈梯形条带;流式细胞术于感染后24h检测到凋亡细胞,其数量在72~96h达到高峰,144h开始下降。研究结果表明,DRV在DEF增殖的过程中具有诱导宿主细胞凋亡的作用。
2008年03期 213-219页 [查看摘要][在线阅读][下载 1015K] [下载次数：251 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：11 ] |[阅读次数：370 ] - 李建丽;陈恩林;李和平;郝春丽;毕丁仁;王泽霖;
利用RT-PCR方法,扩增了1998~2005年间分离的9株H9N2亚型禽流感病毒的NS1基因,对其进行了序列测定和进化分析。序列分析表明,9株AIVNS1基因完整的阅读框均为654bp,编码217个氨基酸,其核苷酸和推导的氨基酸同源性分别为95.4%~99.8%和93.6%~100%;9株病毒的NS1蛋白的C端均有13个氨基酸的缺失;进化分析表明,9株AIV属于A群,且形成一个独立分支,在该分支中,只有Ck/HN/A3/98株属于Ck/HK/Y280/97-like亚类,且与Ck/BJ/8/98的进化关系最近,其余8株属于Ck/SH/F/98-like亚类,说明Ck/SH/F/98-like亚类的H9N2亚型AIV在中国大陆的鸡群中广泛存在。NS1基因的进化及其编码产物的特性分析,为AIV的毒力变异、致病机制、药物靶位点的设计及鉴别诊断的研究奠定了基础。
2008年03期 220-226页 [查看摘要][在线阅读][下载 835K] [下载次数：298 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：5 ] |[阅读次数：333 ] - 赵云蛟;郭利;黄莹;张立世;钱爱东;
对1株梅花鹿源性狂犬病街毒株(DRV)进行全基因组克隆,对全长cDNA进行测序分析。RT-PCR扩增克隆覆盖全基因组9个重叠基因片段,基因组3′和5′末端采取3′-RACE和5′-RACE方法,9个重叠基因片段序列拼接得到DRV全基因组cDNA序列,共11863个核苷酸。DRV毒株全基因组构成与其他狂犬病毒基因组构成相似,由5个编码区组成,基因起始位点和终止位点高度保守,在核蛋白和糖蛋白的重要抗原位点有个别氨基酸发生变异,对已完成全基因组测序的几个基因1型毒株分别进行了N、P、M、G、L基因核苷酸及氨基酸的同源性比较。与其他具有代表性的毒株进行N基因序列比较建立的系统进化树表明,DRV毒株属于基因1型,与中国人用疫苗株3aG同源性最高为94%,与分类位置未确定的北高加索毒株(WCBV)的同源性最低为71%。本研究结果可为狂犬病毒各项分子生物学研究提供理论参考。
2008年03期 227-233页 [查看摘要][在线阅读][下载 339K] [下载次数：198 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：7 ] |[阅读次数：358 ]