- 魏旻希;李少伟;黄博;沈文通;苏永在;张春华;顾颖;杜海莲;张军;夏宁邵;
利用PCR技术从HPV16阳性阴道分泌物标本中获得HPV16 L1基因片段,并将其插入表达载体pTO-T7中,构建重组表达质粒pTO-T7-HPV16-L1;以该重组质粒转化大肠杆菌ER2566并表达HPV16 L1蛋白;所表达的HPV16 L1蛋白经过硫酸铵沉淀、离子交换层析和疏水相互作用层析等纯化步骤后,HPV16 L1纯度达到98%以上,并可在体外装配为直径50nm的病毒样颗粒;动物免疫原性研究结果显示,该病毒样颗粒可诱导高滴度的针对HPV16的中和抗体。上述研究结果表明通过大肠杆菌表达系统制备的HPV16病毒样颗粒具有纯度高,与天然病毒颗粒形态高度相似的特点,并具有高度免疫原性,可以应用于HPV16病毒样颗粒的结构功能研究及HPV16疫苗研发等领域。
2009年04期 v.25 245-250页 [查看摘要][在线阅读][下载 506K] [下载次数：963 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：18 ] |[阅读次数：4 ] - 丁丽新;张勇;李洁;窦相峰;严冬梅;祝双利;安洪秋;许文波;
2007年北京市发生了急性出血性结膜炎(Acute Hemorrhagic Conjunctivitis,AHC)疫情。为鉴定引起这次疫情的致病病原体,采集北京市门诊就诊的AHC患者眼结膜拭子标本共57份,使用PCR或RT-PCR法分别检测临床标本中腺病毒、人肠道病毒70型(Human Enterovirus 70,HEV70)和柯萨奇病毒A组24型变种(CoxsackievirusA24 variant,CVA24v)的基因,其中有38份检测结果为CVA24v阳性,阳性率为66.7%,而腺病毒和HEV70检测结果均为阴性,说明引起本次AHC流行的病原体是CVA24v。使用HEp-2细胞共分离到9株病毒,通过分子定型均鉴定为CVA24v,对9株CVA24v进行全长VP1区扩增和核苷酸序列测定和分析后,发现除0744/BJ/CHN/2007株之外,其它8株在全长VP1区核苷酸水平和氨基酸水平上差异都很小,同源性分别大于99.6%和100.0%,而0744/BJ/CHN/2007株与其它8株CVA24v的核苷酸和氨基酸同源性分别为96.8%~97.2%和99.7%。进化树图显示,2007年北京CVA24v分离株与基因群I中的代表株聚为一簇,代表了基因群I中的第四和第五进化分支,说明本次流行至少存在两个传播链。相对于CVA24v的3C区而言,VP1区是进行分子流行病学研究的更为严谨的靶序列,加强对CVA24v的血清流行病学和分子流行病学监测和研究,了解CVA24v的基因特征和分子进化,对预防和控制CVA24v在中国的流行具有重要意义。
2009年04期 v.25 251-256页 [查看摘要][在线阅读][下载 333K] [下载次数：208 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：11 ] |[阅读次数：3 ] - 王素婷;聂建辉;种辉辉;张春涛;吴雪伶;王佑春;
研究HIV-1膜抗原部分位点的改造对假病毒形成及病毒感染能力的影响。本实验采用环形诱变和DpnΙ筛选的方法对env进行定点突变。用获得的克隆和骨架质粒pSG3△env共转染293FT细胞,收获假病毒后用TZM-bl细胞进行单周期感染试验,检测特定位点改造对功能性假病毒形成能力的影响。改造之前样品S12-42-1的免疫印记的实验结果显示弥散的条带,蛋白大小约160kD,但单周期感染试验中其S/CO(样品信号值与临界值的比值)小于1,即不能形成假病毒。将该样品第457位氨基酸由丙氨酸变成天冬氨酸后,用突变体S12-42M进行单周感染试验,其S/CO值为6.65,表示突变体能够形成假病毒。结果表明HIV-1膜抗原部分位点的改变影响假病毒的形成或假病毒感染细胞的能力。
2009年04期 v.25 257-260页 [查看摘要][在线阅读][下载 643K] [下载次数：386 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：4 ] |[阅读次数：3 ] - 邓瑶;张柯;陈红;刘红梅;吴小兵;阮力;谭文杰;
重组腺相关病毒载体(rAAV)可在动物体内高水平地持久表达外源基因,本研究采用两种rAAV载体(rAAV1与rAAV2)构建了表达丙型肝炎病毒中国分离株包膜糖蛋白(E1E2)的载体疫苗并以之免疫小鼠,分别采用免疫荧光证实其表达与总抗体,用HCV假病毒系统检测其中和抗体水平,用ELISpot分析其细胞免疫应答,结果表明:rAAV1-E1E2重组载体疫苗单针免疫激发的体液应答明显高于rAAV2-E1E2,rAAV1-E1E2单针注射后3个月可在肌肉组织中检出E2蛋白表达及特异性T细胞应答。上述结果提示HCV重组腺相关病毒载体疫苗单针免疫可引起明显持久的体液与细胞免疫应答。
2009年04期 v.25 261-266页 [查看摘要][在线阅读][下载 283K] [下载次数：226 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：4 ] |[阅读次数：3 ] - 谭淑萍;袁振华;田文洪;董小岩;吴小兵;
以纯化的重组AAV2病毒颗粒为抗原免疫小鼠,获得7株稳定分泌抗AAV2衣壳蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株,其中B10和G4两株单克隆抗体具有中和活性,抗体亚型分别为IgG1和IgG2a型。对这两株单克隆抗体与rAAV病毒结合的特性进行了研究。单克隆抗体B10和G4对rAAV2病毒颗粒的结合均具有良好的血清型特异性,并且这种特异结合作用不被肝素阻断。这两株抗体都不阻断AAV2病毒与敏感细胞的结合,提示它们与病毒颗粒的结合位点都不处于AAV2病毒与主要受体结合的部位内。Western blotting检测结果显示,B10与AAV2的三种衣壳蛋白VP1、VP2和VP3均能结合,而G4不能与AAV2的这三种衣壳蛋白结合。这说明B10与AAV2结合的位点位于衣壳蛋白VP1、VP2和VP3的重叠部分处并且可能是线性表位,而G4则可能是针对AAV2病毒颗粒构象表位的抗体。这两种结合特性不同的单克隆抗体为研究AAV2病毒颗粒的表面特性和感染特性提供有用的工具。
2009年04期 v.25 267-273页 [查看摘要][在线阅读][下载 382K] [下载次数：291 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：3 ] - 李文;刘阳;兰蕾;刘铭楠;
从SARS病毒基因组中克隆Orf 9b基因并构建pET32-Orf 9b原核表达质粒,在原核细胞中表达目的重组蛋白并将其纯化,经肠激酶酶切后,得到分子量为11 kD的Orf 9b蛋白。ELISA检测表明重组Orf 9b蛋白可以与SARS康复病人血清反应而不与健康人血清反应。用圆二色光谱和红外光谱初步分析了重组Orf 9b蛋白的二级结构组成。圆二色光谱显示重组Orf 9b蛋白中α-螺旋占12.5%,β-折叠占40%,无规则卷曲占47.5%,红外光谱显示重组Orf 9b蛋白中α-螺旋占13.7%,β-折叠占47.5%,无规则卷曲占37.9%,两种检测方法对重组Orf 9b蛋白结构分析的结果基本一致,提示Orf 9b蛋白富含β折叠,而α-螺旋含量较少。获得该重组蛋白及对其结构的初步分析为进一步研究Orf 9b蛋白的功能奠定基础。
2009年04期 v.25 274-278页 [查看摘要][在线阅读][下载 231K] [下载次数：208 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：3 ] - 刘珊;黄莺;杨鹏;孙志伟;俞炜源;
以乙型脑炎病毒SA14-14-2疫苗株全长基因组克隆质粒pBR-JTF为模板,通过PCR分别扩增prM-E及C-prM-E基因片段,构建表达乙型脑炎病毒结构蛋白的真核表达质粒pCJE-ME及pCJE-CME。将这2种重组质粒用脂质体法转染BHK-21细胞后,质粒pCJE-ME表现明显的细胞毒性,转染细胞不能存活;质粒pCJE-cME可导致筛选到表达JEV结构蛋白的稳定细胞系,这种稳定表达JEV结构蛋白的细胞系通过PCR扩增细胞系基因组、ELISA、Western Blot、间接免疫荧光等方法得到鉴定。研究结果表明在C蛋白存在下,乙型脑炎病毒C-prM-E蛋白可以在BHK细胞中稳定表达,为研制JEV新型复制子颗粒疫苗提供了便利工具。
2009年04期 v.25 279-285页 [查看摘要][在线阅读][下载 365K] [下载次数：257 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：5 ] |[阅读次数：3 ] - 张博;郑岚;黄宇闻;莫琴;王迅;钱开诚;
本研究探讨利用荧光定量PCR技术评价Sindbis病毒经亚甲蓝光化学处理后灭活效果的可行性。研究采用不同光照强度对Sindbis病毒进行亚甲蓝光化学灭活处理,并用SYBR Green I荧光定量PCR对Sindbis病毒的cDNA进行扩增,同时以细胞病变法做平行对照以测定病毒残余滴度。结果显示在亚甲蓝光化学处理过程中,随着光照强度的增强,病毒残余滴度由6.50 LgTCID50/mL逐渐降低至检测限以下,同时病毒核酸的拷贝数显著下降(P<0.05),并与病毒感染性的降低呈线性相关(R2>0.98)。以上结果表明,亚甲蓝光化学灭活法对Sindbis病毒核酸有破坏作用,病毒核酸损伤程度随光照强度的增强而增加,且与病毒感染性的降低存在相关性,提示荧光定量PCR技术评价亚甲蓝光化学法的病毒灭活效果具有可行性。
2009年04期 v.25 286-290页 [查看摘要][在线阅读][下载 207K] [下载次数：210 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：9 ] |[阅读次数：3 ] - 宋克云;张如胜;欧新华;苏良;杨秋林;
建立一种检测Norwalk病毒GⅡ型快速、敏感的一步逆转录环介导等温扩增(Reverse transcription-loop-me-diated isothermal amplification,RT-LAMP)方法。针对Norwalk病毒RNA聚合酶基因特异性序列的6个区域设计4条LAMP引物,65℃保温约120 min,完成对Norwalk病毒GⅡ的扩增,扩增产物通过肉眼观察、SYBR GreenI染色、凝胶电泳及酶切消化进行鉴定。利用RT-LAMP和RT-PCR方法同时检测48份Norwalk病毒GⅡ粪便标本和12份A组轮状病毒标本来验证RT-LAMP方法的特异性;将Norwalk病毒GⅡ RNA一系列稀释后用RT-LAMP和RT-PCR方法进行检测来比较两者敏感性。46份Norwalk病毒GⅡ粪便标本出现LAMP扩增反应:通过肉眼观察、SYBR Green Ⅰ染色和凝胶电泳均能观察到LAMP扩增产物的存在,LAMP产物的特异性通过酶切消化加以证实;2份Norwalk病毒GⅡ粪便标本和12份A组轮状病毒标本未出现RT-LAMP扩增。RT-LAMP与RT-PCR特异性符合率为100%,RT-LAMP和RT-PCR检测Norwalk病毒GⅡ的检测下限均为15.6pg/管。与RT-PCR相比较,一步RT-LAMP法检测粪便中Norwalk病毒GⅡ的方法是一种快速、敏感、特异且准确的方法,有望用于快速检测感染性腹泻暴发时粪便中的Norwalk病毒GⅡ。
2009年04期 v.25 291-295页 [查看摘要][在线阅读][下载 195K] [下载次数：232 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：14 ] |[阅读次数：3 ] - 胡康洪;冯辉;李卉;
通过构建鸭乙肝病毒ε(Dε)的RNA文库并利用指数级富集的配体系统进化技术(SELEX)筛选的策略,获得与反转录酶(P蛋白)高度亲和的适配子(Aptamer),再通过体外引发实验和核酸酶切割方法测定全部适配子的RNA二级结构,以研究鸭乙型肝炎病毒(Duck Hepatitis B Virus,DHBV)中对启动P蛋白引发步骤至关重要的ε结构信息。本研究发现凡是支持P蛋白启动引发的高亲和力适配子中均包含完整的侧向突出结构;而一旦侧向突出被破坏,则适配子均不再支持P蛋白启动引发。本研究的结果表明Dε分子内部的一个完整侧向突出结构对于P蛋白启动引发是必不可少的。
2009年04期 v.25 296-302页 [查看摘要][在线阅读][下载 490K] [下载次数：93 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：3 ] - 周远成;王琴;范学政;徐璐;徐志文;郭万柱;刘俊;陈蕾;汤波;
为研究CSFV强毒感染对猪外周血白细胞的影响,本研究用猪瘟病毒石门株(CSFV SM)感染60日龄仔猪后,分析外周血中CSFV核酸载量动态变化、白细胞亚群变化和白细胞SLAⅠ和SLAⅡDR分子的表达情况。实验结果显示:实验仔猪经CSFV感染后48小时体温升高并可以在血液中检测到CSFV核酸,核酸载量持续升高,在感染后6日(DPI)达到最大值,为2 DPI时核酸载量的104.84±0.98倍;WBC、LYM、PLT数量持续降低,WBC在1DPI和2DPI分别降至65.87%和50.00%,LYM在1~3DPI分别降至70.68%、47.88%和23.29%,PLT数量持续降低,6DPI时仅为初始值的34.59%;NK、γδT、Tc、Th、CD3+CD4+CD8+和CD3-CD4-CD8-淋巴细胞在感染后均不同程度的减少,其中NK细胞在1DPI时减少78.49%,而后变化与1DPI比较差异不显著,γδT、Tc、CD3-CD4-CD8-、CD3+CD4+CD8+在3DPI时分别降至41.74%、43.83%、15.87%和32.96%,Th细胞在感染后持续下降,在6DPI时减少至42.95%;感染后淋巴细胞中表达SLAⅠ分子的细胞数量显著下降,其中CD3-SLAⅠ+细胞含量在1DPI和2DPI分别降至23.07%和15.38%,CD3+SLAⅠ+细胞在2DPI时降至39.19%,表达SLAⅠ分子的粒细胞数量持续升高,在3DPI时由1DPI的92.20%升高至98.30%;粒细胞中SLAⅡ+细胞数量在3DPI时达到最大值,52.76%的粒细胞表达SALⅡ分子,在4DPI时下降至12.54%,在5DPI时仅存4.06%。本研究结果揭示CSFVSM株感染能够通过抑制宿主的早期非特异抗病毒免疫而逃避宿主免疫监视,从而导致免疫抑制发生。
2009年04期 v.25 303-308页 [查看摘要][在线阅读][下载 501K] [下载次数：302 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：10 ] |[阅读次数：3 ] - 高旭;姜成刚;韩秀娥;赵立平;沈荣显;相文华;周建华;
以中国株EIAV的驴强毒株EIAVDV115与疫苗株EIAVFDDV15的S2基因变化规律为依据,利用反向遗传技术对EIAV弱毒疫苗株全基因组感染性克隆pFDDV3-8的S2基因区进行逆向突变,构建了含有强毒株EIAVDV115S2基因区内4个稳定点突变的克隆质粒pFDDVS2r1-3-4-5,将该质粒转染FDD后进行体外继代盲传,经RT-PCR、逆转录酶活性、间接免疫荧光等检测后,显示经EIAV克隆质粒pFDDVS2r1-3-4-5转染的FDD盲传3代后,可在转染的FDD细胞培养物的上清液中检测到EIAV逆转录酶活性;该细胞培养物经RT-PCR和间接免疫荧光检测均呈EIAV阳性;在电镜下可观察到典型EIAV粒子。证明已成功拯救经EIAVS2基因逆向突变后的衍生病毒vpFDDVS2r1-3-4-5。比较vpFDDVS2r1-3-4-5衍生病毒与亲本克隆衍生病毒的复制动力学,表明前者的复制比后者略滞后。以上结果提示,对疫苗株S2基因的突变未明显影响EIAV的体外复制。
2009年04期 v.25 309-315页 [查看摘要][在线阅读][下载 492K] [下载次数：192 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：5 ] |[阅读次数：3 ]