2026年 03期
靶向2型人博卡病毒DR2多肽的单克隆抗体制备及表征分析
德日;张可祥;傅涵浩钰;孙宇;朱汝南;贾立平;赵林清;目的 制备针对2型人博卡病毒（Human bocavirus, HBoVs）VP3蛋白DR2多肽的特异性单克隆抗体（Monoclonal antibody,mAb），并系统鉴定其特异性、亲和力。方法 针对HBoV2与HBoV1 VP3蛋白差异最显著的DR2区，合成特异性多肽并免疫BALB/c小鼠。通过细胞融合、杂交瘤筛选法，获得稳定分泌抗HBoV2-DR2单克隆抗体的杂交瘤细胞株。采用酶联免疫吸附（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）、间接免疫荧光（Indirect immunofluorescence assay,IFA）鉴定抗体的特异性；利用生物膜层干涉技术（Bio-layer interferometry,BLI）测定抗体亲和力常数（KD）。结果 成功获得一株稳定分泌抗HBoV2-DR2 mAb的杂交瘤细胞株，命名为3A6，亚类鉴定为IgG1/κ型。ELISA和IFA结果显示，mAb 3A6与原核表达的HBoV2 VP3及表达HBoV2 VP3的细胞呈强阳性反应，而与HBoV1 VP3仅存在弱反应，与表达HBoV1 VP3的细胞未见阳性反应；在BLI检测中，其与HBoV2 VP3亲和力高，KD值达2.09×10~(-10)M，与HBoV1 VP3未见显著结合，无KD值；提示3A6的区别于HBoV1的HBoV2型特异性。结论 本研究成功制备了一株具有高亲和力的抗HBoV2 DR2区的单克隆抗体，为HBoV2诊断试剂及药物研发奠定基础。
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高致病性H5N1禽流感病毒HA抗原谱演化特征和基因型更替分析
蒲思宇;崔思敏;罗军皓;何佩青;朱海军;高荣保;目的 探究高致病性H5N1禽流感病毒HA基因型更替及其在2024-2025美国奶牛场疫情传播过程中的分子进化轨迹，阐述抗原表位关键氨基酸位点的演化规律及其对抗原谱的影响。方法 基于GISAID数据库高致病性H5N1禽流感病毒HA基因序列，运用系统发育分析、正向选择压力分析及关键氨基酸位点变异频率统计，分析基因进化和抗原位点变化特征，结合线性抗原表位评估技术分析关键位点的结构功能影响。结果 H5N1病毒HA总体上呈现出时间拓扑连续性，分布于侧枝的2.3.4.4b谱系毒株紧邻早期祖先分支，表现出“进化迟滞”，而2.3.4.4h分支虽遗传距离较远，却通过131和139位点的回复突变呈现抗原表型的‘返祖’。2024-2025美国奶牛场H5N1疫情经历了早期主导的B3.13基因型向D1.1基因型显著的更替。B3.13基因型呈现出典型的连续抗原漂移特征，其中位于130环关键抗原区的147位点受到正向选择（P<0.1）；抗原性预测显示该变异改变了局部抗原指数评分，且可能影响表位特征，提示其可能参与免疫逃逸与宿主适应过程。D1.1基因型其131、211及226等关键抗原位点的氨基酸组合趋同于2021年北美早期祖先株HA21-NL，呈现出遗传距离与抗原表型的非线性分离特征，类似于已报道的2.3.4.4h分支的抗原非线性演化模式。结论 H5N1病毒在新型哺乳动物宿主中采用了复杂的双重进化策略，即通过关键位点突变（如V147M）实现适应性漂移，或重现类似2.3.4.4h的机制实现早期抗原表型的回归。这种演化规律重塑了当前的流行毒株抗原谱，为评估现有疫苗匹配度及预警大流行风险提供依据。
一株牛疱疹病毒4型流行株的分离鉴定及其分子演化特征分析
赵妍;张财祯;王辉;陆长斌;李平花;杨行;马雪青;李冬;朱新荣;杜晓华;卢曾军;刘霞;孙普;目的 为了掌握近期我国牛群间牛疱疹病毒4型（Bovine herpesvirus 4,BoHV-4）的分子演化特征与生物学特性，并评估对非天然宿主中妊娠个体的感染致病性。方法 采集某奶牛场流产奶牛的阴道拭子及血液样品，采用PCR方法检测BoHV-4和其他牛常见易感病毒；将BoHV-4阳性样品接种MDBK细胞进行病毒分离鉴定，通过测定TCID_(50)、绘制多步生长曲线、分析主要基因（gB、gH和TK）遗传演化分析，明确分离毒株的基本分子生物学特征；将病毒液（10~(6.5)TCID_(50)/0.1 mL）以滴鼻+肌注的方式接种妊娠中期的母兔，滴鼻和肌注各0.5 mL/只，观察其感染与致病能力；对流产奶牛进行6个月随访，监测其BoHV-4抗体水平及病原携带情况，探究该病毒对母牛繁殖能力的持续影响。结果 仅流产奶牛的阴道拭子检测出了BoHV-4基因，成功分离获得1株BoHV-4流行株，命名为BoHV-4 GSHZ/06/2025株；该毒株第7代病毒接种细胞后约72 h达到复制高峰。遗传演化分析表明，该毒株基于TK基因可归属Genotype 1，基于gB和gH基因可归属Genotype 2，且重组分析提示其gH基因可能为Genotype 1和Genotype 2病毒重组演化产生。动物感染试验显示，滴鼻+肌注的联合接种方式未能使该分离毒株感染妊娠母兔。随访结果显示，20头流产奶牛6个月后阴道拭子和血清中BoHV-4核酸均为阴性，而血清BoHV-4抗体阳性率达100%。结论 本研究成功分离的BoHV-4流行毒株不同基因存在明显的遗传演化差异，其发生的重组事件极有可能改变病毒感染致病力；该毒株在妊娠母兔模型中未建立有效感染，提示BoHV-4更可能作为机会性或协同致病因子参与牛生殖系统疾病的发生。本研究从流产的奶牛上成功分离到1株新的BoHV-4流行株，提示我们需重新审视BoHV-4感染对母牛繁殖性能的影响，其潜在的危害性值得重点关注，本研究结果也为BoHV-4的流行防控及其相关研究提供了基础数据。
犬细小病毒主要亚型VP2与NS1密码子使用模式及演化动态分析
阿依达娜·哈尔恒;粟硕;董瑞华;目的 探究犬细小病毒（Canine parvovirus, CPV）2a、2b、2c亚型VP2及NS1基因的密码子使用偏好性（Codon usage bias, CUB）及演化特征。方法 基于全球3583条VP2和855条NS1完整编码序列，通过碱基组成、有效密码子数（Effective number of codons, ENC）、相对同义密码子使用度、密码子适应指数（Codon adaptation index, CAI）指标，结合ENC-plot、中性绘图、PR2-plot、时间趋势分析、地区及气候相关性分析等，评估突变压力与自然选择对密码子使用偏好的影响，探究各亚型演化特点及宿主适应性的差异。结果 VP2与NS1基因的ENC值分别约为32.7和37.8，且VP2具有更显著的CpG抑制特征。时间趋势分析显示，CPV-2c的CUB相关指标变动幅度最为显著，两基因的ENC值均随时间显著升高，且宿主适应性呈非对称变化，VP2的CAI值随时间升高，而NS1的CAI值则随时间降低。CPV-2a两个基因的ENC、GC3s与CAI指标均随时间轻微上升；CPV-2b的密码子偏好特征指标随时间的变化较为平稳。此外，亚洲地区CPV序列ENC水平高于其他地区，密码子使用偏好性相对较弱。结论 自然选择是CPV主要亚型VP2和NS1基因密码子使用偏好的主导因素。CPV-2a和CPV-2b的演化模式较CPV-2c相对平稳。CPV-2c的VP2及NS1基因的宿主适应模式值得进一步深入研究。研究可为CPV疫苗优化提供参考，通过NS1密码子去优化增强减毒效果，或优化VP2密码子组成以提升亚单位疫苗的抗原表达效率。
猪急性腹泻综合征冠状病毒亚基因组RNA SYBR Green实时荧光定量PCR检测方法的建立及评价
陈凝雪;黄超;张柳露;李程;邱帅;孙媛;目的 为建立猪急性腹泻综合征冠状病毒（Swine acute diarrhea syndrome coronavirus,SADS-CoV）亚基因组RNA(sgRNAs)SYBR Green实时荧光定量RT-PCR检测方法。方法 根据SADS-CoV的5'-leader、N和S基因序列设计特异性扩增引物，进行SYBR Green实时荧光定量PCR检测，并对该方法的敏感性、特异性及与分别检测gRNA-N/S基因的相关性进行了评价。结果 该方法检测限可达到10拷贝/μL，且与其他猪冠状病毒均无交叉反应，具有良好的敏感性和特异性；与分别检测gRNA-N/S基因的荧光定量结果对比，整体定量结果反映的sgRNAs随SADS-CoV感染时间延长的动态变化趋势一致，且特异性强，可通过检测亚基因组RNA(sgRNAs)来快速判断病毒活性。结论 本文建立的SADS-CoV亚基因组RNA(sgRNAs)SYBR Green实时荧光定量PCR法可区分和定量SADS-CoV在复制过程中产生的不同sgRNAs，为后续病毒的复制转录调控机理和相关抗病毒机制的研究提供了有效检测手段。
微管依赖的自噬体在猪流行性腹泻病毒早期感染中的作用
姚飞;李燕;马永豪;安达;裴义;冯永智;单衍可;刘斐;目的 猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）是导致仔猪腹泻的主要冠状病毒之一，给我国养猪业造成巨大经济损失。PEDV感染与宿主细胞自噬通路密切相关，目前研究多集中于自噬对PEDV复制阶段的调控，而自噬在病毒感染早期的作用及其与细胞骨架的关联尚不清楚。本研究旨在阐明PEDV感染早期自噬的动态变化，并解析微管在病毒与自噬体互作过程中的作用。方法 采用亲脂性染料DiD对PEDV进行荧光标记并验证其感染性。通过蛋白免疫印迹及荧光成像检测PEDV感染早期自噬激活水平及其时间动态。利用单病毒示踪观察DiD-PEDV与GFP-LC3标记自噬体及mCherry标记微管的共定位情况。使用Nocodazole解聚微管，并利用GFP/mCherry-LC3自噬体酸化成熟指示系统，分析其对PEDV诱导自噬、自噬体成熟以及病毒膜融合（DiD荧光增强）的影响。结果 PEDV在感染早期即可诱导自噬，并呈时间依赖性增强。单病毒示踪显示，DiD-PEDV在感染后约2 h内与自噬体、微管同时发生共定位。Nocodazole解聚微管后，PEDV诱导的自噬激活明显减弱，病毒与自噬体的共定位比例下降。微管解聚还导致自噬体酸化成熟相关表型减弱，并伴随着DiD荧光增强现象降低。结论 上述研究解析了PEDV感染早期可诱导自噬，并利用微管依赖的自噬体成熟来促进病毒膜融合的过程，为理解PEDV早期感染机制及开发抗病毒药物提供理论依据。
宿主蛋白SPCS1与牛病毒性腹泻病毒p7蛋白的相互作用研究
高冯思月;张成远;马思琪;陈俊贞;李亚;关团;丁剑;史慧君;付强;目的 为探究信号肽酶复合体亚基1(signal peptidase complex subunit 1,SPCS1)与牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus,BVDV）p7蛋白相互作用的分子机制。方法 通过Pull down试验验证这两种蛋白是否存在相互作用，使用激光共聚焦观察SPCS1与p7蛋白的共定位情况，进一步利用分子动力学模拟筛选SPCS1与p7相互作用的关键位点，并对关键位点进行定点突变，再利用Pull down技术验证突变后关键位点的作用。结果 SPCS1与p7蛋白存在相互作用，共转染细胞中检测到蛋白表达，二者在细胞内共定位且相互作用强度随时间增加而增强；25-50 ns时SPCS1-p7复合物趋于稳定，SPCS1与p7结合的关键位点分别是M23、F30、W67、W77，点突变后p7与M23、W67、W77相互作用减弱。结论 本研究发现SPCS1与BVDV p7蛋白相互作用，且二者互作位点为M23、W67、W77，为探究SPCS1通过与病毒非结构蛋白互作影响其复制的机制提供有力支持，为黄病毒科瘟病毒属的机制研究提供一定思路。
表达小反刍兽疫田间毒株HN糖蛋白重组山羊痘毒株的构建及其增殖特性分析
陈韵;任善会;杜新潮;朱开宇;王会宝;仝丽娜;高小龙;目的 小反刍兽疫（Peste des petits ruminants, PPR）和山羊痘（Goat pox）是两种危害小反刍动物的高度接触性传染疫病，严重阻碍了我国养羊产业的健康发展。方法 为构建表达小反刍兽疫病毒（Peste des petits ruminants virus, PPRV）HN蛋白的山羊痘重组病毒载体二联疫苗，以先前构建的p UC19T-ΔTK-RFP载体，利用同源重组技术将PPRV HN基因克隆至p UC19T-ΔTK-RFP上构建p UC19T-ΔTK-PPRV-HN转移载体。将转移载体转染Vero细胞，通过与红色荧光山羊痘病毒（GTPV-ΔTK-RFP）重组进行病毒拯救。利用有限稀释法将拯救成功的重组病毒（GTPV-ΔTK-PPRV-HN）进行纯化。再通过蛋白免疫印迹、间接免疫荧光和测序验证GTPV-ΔTK-PPRVHN重组病毒的生物学及其增殖特性。结果 结果表明，本研究成功构建GTPV-ΔTK-PPRV-HN重组病毒并且该重组病毒能够表达PPRV HN蛋白，重组病毒生长特性良好。结论 本研究为PPRV和GTPV的二联疫苗提供理论基础和实践依据，将有利于保障养羊产业的健康发展，助力乡村振兴。
草鱼呼肠孤病毒感染早期非裂解性释放的初步研究
樊炎昌;吕利群;目的 探究草鱼呼肠孤病毒（Grass carp reovirus,GCRV）在感染早期是否发生非裂解释放，并探索其潜在的细胞机制。方法 利用透射电子显微镜观察CIK细胞中GCRV非裂解释放现象，利用免疫荧光分析鉴定溶酶体在非裂解释放中的功能，利用抗体中和试验研究大型和中型囊泡保护GCRV病毒免受抗体介导的中和作用，利用荧光定量PCR技术对病毒粒子进行定量分析。结果 透射电子显微镜分析显示，单个病毒颗粒被包裹在与质膜融合的膜性结构中。免疫荧光实验表明，感染早期病毒结构蛋白与溶酶体标志物显著共定位，提示溶酶体与胞浆中新组装的病毒颗粒存在相互作用。从感染细胞培养上清中分离出含有病毒颗粒的囊泡结构，抗体中和实验证实大、中型囊泡可保护其内的病毒颗粒免受抗体介导的中和作用。此外，溶酶体抑制剂处理可部分减少病毒颗粒的释放，表明溶酶体参与此释放过程。结论 类似于哺乳动物正呼肠孤病毒所描述的囊泡介导的非裂解释放方式，GCRV-JX01可能在感染早期利用大、中型膜包被囊泡和溶酶体进行非裂解释放。综上，这些初步发现支持GCRV-JX01在感染早期存在子代病毒颗粒非裂解释放的现象。
多株猪流行性腹泻病毒G2c毒株的分离与免疫原性比较
杨孟迪;郭容利;莫嘉文;赵永祥;宋旭;刘诗雨;王祎;孙敏;杨珊珊;王先炜;李彬;范宝超;目的 本研究系统比较五株临床新分离的猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea, PEDV）G2c亚型毒株的免疫原性。方法 将新分离PEDV毒株GX2311、QD2306、JX2307、NT2023和WF2023分别于Vero细胞中传代至第5代，测定S基因全长序列并进行遗传进化分析，通过生长曲线分析各毒株体外复制动力学，并分别制备灭活疫苗进行小鼠免疫，评估各毒株的免疫原性。结果 结果显示，新分离五株病毒均属于PEDV G2c亚型；生长动力学测定发现QD2306具有最高的增殖滴度，在感染后36 h，病毒滴度约为10~(4.5) TCID_(50)/mL；统一调整病毒滴度至10~(3.5) TCID_(50)/mL，经β-丙内酯灭活后，与佐剂ISA 201充分乳化制备灭活疫苗；对免疫后小鼠血清进行抗体测定，发现五株灭活疫苗均能显著诱导小鼠产生病毒特异性IgG抗体，其中QD2306株灭活疫苗诱导的中和抗体水平最高，其对同源毒株的中和效价为1:32，对G2b亚型毒株的中和效价为1:24。结论 上述结果提示，新分离的五株G2c亚型PEDV毒株中，QD2306株具有更优的免疫原性，可作为候选疫苗株进一步开展免疫保护与交叉保护研究。