呼吸道病毒研究专题论著

  • 融合表达新冠病毒S1与N蛋白的非复制型重组腺病毒的构建与鉴定

    毛彤瑶;张鹏;姜苏芮;李丹地;段招军;

    体外构建融合表达新型冠状病毒(SARS-CoV-2)S1抗原与N抗原的复制缺陷型重组腺病毒疫苗,为深入开展该疫苗免疫原性的研究提供基础。利用Overlap PCR和同源重组方法构建插入SARS-CoV-2的S1-N基因的重组腺病毒质粒pKAd5-S1-N,通过琼脂糖凝胶电泳、多酶切、测序等方法鉴定重组质粒正确性;重组质粒转染HEK293A细胞获得病毒毒种AdV5-S1-N并扩增,氯化铯密度梯度离心法纯化病毒,有限稀释分析法测病毒滴度,Western blot方法验证AdV5-S1-N重组腺病毒S1-N融合蛋白表达情况;将AdV5-S1-N疫苗通过肌肉注射途径免疫BALB/c小鼠,第14d采集颌下静脉血,ELISA法检测血清针对S1和N蛋白抗原的特异性抗体滴度。成功获得滴度为9.45×10~(11)IU/mL的重组腺病毒AdV5-S1-N。Western blot结果发现:AdV5-S1-N感染细胞后,融合蛋白可正常表达,与抗S1蛋白及抗N蛋白抗体均有特异结合。ELISA结果显示免疫重组腺病毒的小鼠可产生针对S1和N蛋白的特异性IgG抗体。应用复制缺陷型腺病毒载体成功获得融合表达SARS-CoV-2 Omicron突变株S1-N蛋白的高滴度重组腺病毒,该重组病毒能在小鼠诱导针对S1和N蛋白的特异性免疫应答,为后续深入研究和评价该候选疫苗奠定了基础。

    2024年02期 v.40 225-232页 [查看摘要][在线阅读][下载 1200K]
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  • 一叶抗流感胶囊对人冠状病毒229E湿热疫毒袭肺小鼠药理作用研究

    张敬升;赵荣华;张薇;冀祖恩;庞博;徐英莉;曹姗;孙静;郭姗姗;彭一峰;崔晓兰;

    了解一叶抗流感胶囊对人冠状病毒229E(Human coronavirus 229E,HCo V-229E)湿热疫毒袭肺小鼠的药理作用,为扩展其临床应用提供参考。使用HCo V-229E滴鼻感染和湿热环境造模小鼠,考察一叶抗流感胶囊高、中、低不同剂量组[0.704g/(kg·d)、0.352g/(kg·d)、0.176g/(kg·d)三个剂量]对小鼠的肺指数、病毒载量和小鼠肺组织中IL-6、IL-10、TNF-α含量及下丘脑中PGE2、cAMP含量,同时检测小鼠外周血中T淋巴细胞亚群和B淋巴细胞比例,并设西药磷酸氯喹和中成药连花清瘟颗粒作为阳性对照药。一叶抗流感胶囊三个剂量组均可降低小鼠肺指数,高剂量组和中剂量组可降低肺炎模型小鼠的病毒载量,三个剂量组肺组织中TNF-α、IL-6及IL-10含量与模型组比较均下降,下丘脑中c AMP、PGE2含量与模型组比较均降低,且差异具有统计学意义;高、中剂量组外周血CD4~+、CD8~+T百分比与模型组比较升高,差异有统计学意义;高、中剂量组外周血B细胞百分比与模型组比较均下降,但差异无统计学意义。表明一叶抗流感胶囊对HCo V-229E湿热疫毒袭肺小鼠模型具有治疗作用。

    2024年02期 v.40 233-240页 [查看摘要][在线阅读][下载 1075K]
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  • 新型冠状病毒奥密克戎变异株感染者呼吸道排毒规律研究

    包恬淼;冯晔囡;毛乃颖;陈操;

    本文通过分析采集的鼻咽拭子样本新冠病毒核酸Ct值,探索我国奥密克戎变异株流行时期感染者的排毒规律及影响因素,为预判不同类型病例的传染性和疾病进展提供科学依据。研究纳入某地区457例SARS-CoV-2核酸阳性感染者的1 462份鼻咽拭子样本。提取病毒总RNA,荧光定量PCR法确定样本新冠病毒Ct值。设定Ct值<35为阳性,比较核酸检测阳性后不同时间点Ct值以及不同年龄、性别、疫苗接种分组间Ct值的差异。结果表明感染者ORF1ab和N基因的平均Ct值在首次核酸阳性后的第1周均最低(ORF1ab:32.36±0.3949; N:31.89±0.3792),ORF1ab基因的平均Ct值在首次核酸阳性后第2周转阴,而N基因的平均Ct值在首次核酸阳性后第3周转阴。不同年龄组新冠病毒感染者ORF1ab和N基因的Ct值变化具有统计学差异(ORF1ab:P=0.011;N:P=0.0042)。其中,在第3周,老年组Ct值显著低于中青年组;在第4周,老年组和中青年组的Ct值显著低于儿童组。不同性别和疫苗接种情况分组间Ct值变化均无统计学差异。本研究结果显示,年龄是影响新冠病毒感染者病毒载量变化的主要因素。

    2024年02期 v.40 241-247页 [查看摘要][在线阅读][下载 1144K]
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  • 青年人群感染Omicron的细胞因子动态变化特征

    宗可鑫;罗琴;王璐璐;宫悦;程迁;朱人和;薛光瑜;胡羽婷;宋娟;宋芹芹;杜海军;高晨;韩俊;

    为了评价2022年12月至2023年3月北京市SARS-CoV-2 Omicron BA.5和BF.7变异株感染青年人群感染前和感染后7d、14d和21d细胞因子免疫谱的动态变化,预防过度炎症反应和严重疾病的发生,采用Cytek Aurora全光谱流式细胞仪(Cytek, America)检测15例感染者在SARS-CoV-2感染前、感染后(7d、14d和21d)的血清样本中12种细胞因子的表达水平,评价细胞因子在SARS-CoV-2感染前后的动态变化特征。本研究成功构建了SARS-CoV-2感染青年人群细胞因子免疫谱的纵向研究队列。研究结果发现感染SARS-CoV-2后,各细胞因子与感染前相比均有显著的动态变化。IL-6、IL-17A、MIP-1β在感染后第7d显著升高,第14d和第21d逐渐下降。与感染前相比,感染后IL-2、IL-4、IL-22和IL-9的表达水平显著升高,并维持在较高水平一直持续至21d。与感染后IL-6的快速升高相比,TNF-α、IL-10、IFN-γ、IL-8、和RANTES在感染后缓慢升高,在第14d或第21d达到最高表达水平,提示这些细胞因子的变化伴随着疾病进展的发展。SARS-CoV-2感染后,各细胞因子与感染前相比均显著升高(P <0.05),促炎和抗炎相关细胞因子在SARS-CoV-2感染后维持了适当的平衡,确保了感染后不发展为严重感染。虽然SARS-CoV-2可以在短时间内被清除,但细胞因子反应将在宿主体内持续21d以上。

    2024年02期 v.40 248-254页 [查看摘要][在线阅读][下载 1220K]
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  • 新型冠状病毒Beta变异株感染C57BL/6小鼠肺组织转录组分析及趋化因子实验验证

    张高倩;吴长城;黄保英;李涵;霍恕婷;叶飞;赵莉;阿茹罕;张钟贤;沈晓玲;谭文杰;

    研究旨在通过从转录组水平分析新冠病毒Beta变异株感染C57BL/6小鼠肺部的基因表达变化,以揭示引发轻症肺部损伤的关键宿主因子。首先构建Beta变异株感染C57BL/6小鼠模型,并对感染和未感染第3天(3d)小鼠的肺组织进行病原检测、病理分析以及差异表达基因分析。最后,筛选可能导致肺部损伤的5个炎症反应关键基因进行RT-qPCR验证。研究结果显示Beta变异株能感染C57BL/6小鼠肺部并导致轻度病理损伤。在感染的小鼠中,Beta变异株激活了肺组织的天然免疫应答,主要通路包括Toll样受体信号通路、Ⅰ和Ⅱ型干扰素反应、白细胞趋化反应和细胞因子反应等。通过对重症与轻症感染小鼠的肺组织转录组比较,筛选出与疾病严重程度相关的炎症反应趋化因子,包括Ccl2、Ccl7、Cxcl9、Cxcl10和Cxcl14。通过RT-qPCR验证,基因表达变化趋势与转录组结果一致,表明这些趋化因子过度激活与肺部病理表型损伤程度相关。本研究揭示了Beta变异株感染小鼠肺部激活宿主炎症反应通路关键因子,可能是引发小鼠肺部轻度病理损伤的主要诱因之一,这为预防和治疗新冠病毒感染提供了有利的研究靶点。

    2024年02期 v.40 255-265页 [查看摘要][在线阅读][下载 1587K]
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  • 基于RT-qPCR方法对新冠病毒4种基因型鉴定的可行性研究

    杨潇雨;牛培华;田晓灵;王衍海;夏百成;赵一鸣;燕鸽;程平;郑丽舒;马学军;王佶;

    严重急性呼吸道综合征冠状病毒2(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)的广泛传播强调了对该病毒进行持续监测的紧迫性,以便早发现并采取预防措施。虽然全基因组测序(Whole genome sequencing, WGS)作为SARS-CoV-2检测的金标准,但是其专业性和昂贵成本限制了其在各种情境下的广泛应用。在资源匮乏的地区,迫切需要一种低成本高效率的替代方法。实时荧光定量PCR(Real-timereverse transcription quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)提供了一种经济、快速的方法,同时有效补充了WGS方法。本研究旨在验证SARS-CoV-2 Omicron BF.7/BA.5.2/XBB/BQ.1及亚分支变异株单重核酸检测试剂盒(RT-qPCR法)的性能,并通过对101例SARS-CoV-2阳性临床样本进行评估,验证其在实际应用中的可行性。研究结果显示,该试剂盒与“野生型”SARS-CoV-2、Alpha、Beta、Delta变异株和甲型流感病毒参考株之间无交叉反应,最低检测限为100拷贝/mL。在101例新冠病毒核酸阳性样本中,该试剂盒对Omicron BF.7/BA.5.2/XBB/BQ.1及亚分支变异的检测结果与WGS检出结果完全一致。因此,该RT-qPCR试剂盒为SARS-CoV-2 Omicron变异株亚型的快速鉴定提供了一种简单、经济且高效的方法,可作为WGS的有效补充方案。

    2024年02期 v.40 266-273页 [查看摘要][在线阅读][下载 1574K]
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  • 应用气-液两相呼吸道类器官从中国临床住院患儿中分离鉴定人副流感病毒1/2/3

    余玙璠;吴伟波;牛培华;宋敬东;霍威邦;胡月超;刘俊彤;魏岚;邓瑶;杨扬;朱娜;谭文杰;

    人副流感病毒(Human parainfluenza viruses,hPIVs)是引起人类呼吸道感染的重要病原体之一,目前我国相关临床毒株资源有限,本研究旨在获得近期流行、背景明晰的hPIVs临床分离株。应用原代人呼吸道上皮细胞分化的气-液界面呼吸道上皮类器官(Air-liquid interface human airway epithelial organoid,HAE),从深圳市第三人民医院2016~2017年住院患儿hPIVs阳性咽拭子标本中分离获得hPIV1/2/3,分别命名为hPIV1/C-Tan/SZ01/2016、hPIV2/C-Tan/SZ01/2017、hPIV3/C-Tan/SZ01/2017。通过逆转录荧光定量PCR (Reversetranscriptionquantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)检测病毒核酸扩增、免疫荧光检测病毒蛋白在HAE的表达、负染及超薄切片透射电镜观察病毒形态和细胞定位,并对传代过程中病毒的活性、遗传稳定性和基因组特征进行分析。结果表明基于HAE分离hPIVs可以高效获得hPIVs临床分离株,所获毒株具有典型的病毒形态特征。三种hPIVs在HAE中复制良好且遗传稳定,病毒滴度均可达到约107 TCID50/100μL。对分离获得的hPIV1/2/3临床分离株进行全基因组及HN基因进行序列测定,结果表明:hPIV1全长为15568bp,属于hPIV1 C亚型;hPIV2全长15694bp,属于hPIV2 A3亚型;hPIV3全长15443bp,属于hPIV3 C3亚型,提示3株临床分离株与我国普遍流行的基因型相一致。综上,本研究应用HAE从近期住院患儿临床样本中成功分离获得生物学特性和基因组背景清晰且遗传稳定的hPIV1/2/3毒株。这些临床流行毒株资源的分离鉴定,为hPIVs的感染特点和致病机制的深入研究及抗病毒药物筛选和疫苗研发奠定了基础。

    2024年02期 v.40 274-282页 [查看摘要][在线阅读][下载 1693K]
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  • B型流感疫苗候选株在MDCK悬浮细胞上培养工艺优化研究

    武毓姝;孙伟洋;赵梦琳;夏叶婷;冯越;罗敏;任娟;高鸿博;王铁成;夏咸柱;高玉伟;闫芳;

    为了大规模生产重组B型流感疫苗候选株rIBV,本研究探索了rIBV在无血清MDCKs细胞上的最佳培养条件,再扩大到生物反应器中优化工艺参数,经过连续传代15代后测定了MDCKs细胞源毒种rIBV的遗传稳定性和病毒滴度。通过对病毒培养条件进行优化,我们确定了r IBV在MDCKs细胞上增殖的最佳培养条件是TOI为72 h、MOI=0.001、CCI为4.0×10~6细胞、TPCK胰酶浓度为2μg/m L、50%DO和pH=7.2±0.5。rIBV在MDCKs细胞上连续传代15代后仍然具有高度遗传稳定性。相比于鸡胚源rIBV株,适应MDCKs细胞生长15代后rIBV株的EID_(50)由10~(6.25)/mL提高至10~(9.5)/mL,TCID_(50)由10~(4.5)/mL提高至10~(8.25)/mL。本研究对重组B型流感疫苗候选株r IBV在MDCKs细胞上的培养工艺进行了优化,获得一株具有高感染力和高病毒滴度的MDCKs细胞源疫苗候选株r IBV,为下游流感疫苗生产及纯化工艺奠定了基础。

    2024年02期 v.40 283-292页 [查看摘要][在线阅读][下载 1303K]
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  • 人呼吸道合胞病毒SH蛋白混合多肽免疫原性初步研究

    郭宏;宋洋;李海;时雨晴;胡宏俏;江洁;郭晋源;毛乃颖;曹蕾;张燕;

    本研究旨在探讨人呼吸道合胞病毒(Human respiratory syncytial virus,HRSV)小疏水蛋白(Small hydrophobic protein,SH)T细胞表位肽的免疫原性和保护效果。通过设计并合成覆盖SH蛋白序列全长的10条多肽,利用HRSV感染小鼠的脾淋巴细胞进行IFN-γ-酶联免疫斑点(Enzyme-linked immunospot assay, ELISpot)的检测,筛选出5条能显著刺激IFN-γ产生的SH蛋白T细胞表位多肽。将其与CpG和磷酸铝(AL)佐剂配制成混合多肽疫苗,两次皮下给药的方式免疫C57BL/6J小鼠,评价其免疫原性和保护效果。结果显示,与佐剂对照组相比,SH蛋白混合多肽疫苗可以诱导免疫后的小鼠产生抗原特异性IgG抗体和Th1偏向的T细胞免疫应答,降低HRSV感染后肺病毒载量,并减轻肺脏病理损伤。研究结果表明,SH蛋白混合多肽通过免疫小鼠可以引起良好的免疫原性,并保护小鼠抵抗HRSV的感染。为进一步研究基于SH蛋白的HRSV多肽疫苗提供了科学依据。

    2024年02期 v.40 293-301页 [查看摘要][在线阅读][下载 1336K]
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  • 呼吸道合胞病毒NS2蛋白单克隆抗体的制备及初步研究

    王亚娟;陈娇;陈志华;茹毅;郑海学;裴晶晶;

    呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus,RSV)是一种引起婴幼儿下呼吸道感染的RNA病毒,其非结构蛋白(Nonstructural protein 2,NS2)在病毒复制和宿主抗病毒免疫中起到关键作用,但目前尚无商品化NS2单克隆抗体。本研究选取NS2基因,经密码子优化后构建重组质粒pET-32a-NS2。将该重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经16℃诱导表达后,对表达蛋白进行SDS-PAGE鉴定。应用亲和层析技术纯化重组蛋白,将纯化的蛋白免疫小鼠制备单克隆抗体,并将该单克隆抗体用于Western blot分析、免疫荧光检测和免疫沉淀反应。结果表明,诱导后的重组蛋白为可溶性表达,并经纯化后得到高纯度的NS2蛋白;纯化的NS2蛋白免疫小鼠后,获得了一株特异性强、反应性好的RSV NS2单克隆抗体4A4 2B2,其亚型为IgG1,且抗体效价可达1∶1024000;使用该单克隆抗体鉴定出RSV NS2蛋白在转染和感染细胞中正常表达,且NS2主要分布在细胞质中,在细胞核周围形成点状聚集体;在免疫沉淀反应中,该单克隆抗体作为捕获抗体能够特异性结合细胞中表达的NS2蛋白,为NS2蛋白的功能研究奠定了基础。

    2024年02期 v.40 302-313页 [查看摘要][在线阅读][下载 1668K]
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人类病毒研究论著

  • 水痘带状疱疹病毒gE-Foldon融合蛋白的表达及免疫效果的分析

    李海鑫;曹蕾;郭晋源;孙馨;胡宏俏;时雨晴;张丽;武婕慧;谢智博;张瑶;张燕;李海;李栋;

    水痘带状疱疹病毒(Varicella-zoster virus,VZV)是引起全球老年人带状疱疹(Herpes zoster,HZ)的主要病原体,VZV gE蛋白是诱导机体产生免疫应答的主要结构蛋白,基于gE蛋白设计的重组蛋白疫苗Shingrix已经在我国批准上市。多种研究表明聚体蛋白可以诱导更强的免疫应答,本研究应用中国仓鼠卵巢细胞CHO-S表达连接Foldon结构域的蛋白(gE-Foldon)、连接Fc片段的蛋白(gE-Fc)和gE蛋白。三种抗原(gE-Foldon、gE-Fc和gE)分别联合AlOH+CpG佐剂,比较在BALB/c小鼠中的免疫效果,同时,将商品化的Shingrix作为对照。SDS-PAGE和WB结果显示成功表达纯化三种抗原,非还原条件下可以观察到gE-Foldon以三聚体形式存在。与gE和gE-Fc抗原相比,gE-Foldon在小鼠中诱导产生的IgG抗体(40492)和中和抗体滴度(1190.5)最高(P<0.01),与Shingrix相当。此外gE-Foldon诱导小鼠产生的分泌IL-2、IL-4的淋巴细胞数量显著高于其他免疫组(P<0.0001,P<0.05)。综上所述,gE-Foldon蛋白联合AlOH+CpG佐剂可诱导较强的体液和细胞免疫应答,因此可以作为预防HZ的潜在候选疫苗。

    2024年02期 v.40 314-325页 [查看摘要][在线阅读][下载 1360K]
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  • IL1R1基因敲除对于柯萨奇病毒A10感染C57BL/6乳鼠的影响

    刘长坤;贺雅娜;张子寒;胡云光;郑惠文;刘龙丁;

    本研究通过柯萨奇病毒A组10型(Coxsackievirus A10, CV-A10)感染C57BL/6野生型乳鼠和白细胞介素-1受体1型(Interleukin 1 Receptor 1,IL-1R1)缺失的C57BL/6乳鼠,比较两者之间的临床症状、病毒体内增殖特征和病理特征差异,以探讨IL-1R1基因缺失对于CV-A10感染乳鼠的影响。本研究采用颅内方式感染C57BL/6野生型和IL-1R1~(-/-)乳鼠,每日记录乳鼠临床症状及死亡情况;两组乳鼠感染后于1、3、5、7、9d处死,并采集各组织样本。通过实时荧光定量PCR(Real-time reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测组织内病毒基因拷贝数;使用HE染色检测乳鼠组织的病理学变化;RT-qPCR检测病毒感染乳鼠后的不同时间点组织内的细胞因子mRNA转录水平;利用免疫荧光分析对IFN-γ、IL-1β、IL10的细胞因子表达进行分析。结果发现相比于空白对照组,随着感染进程的增加,两组乳鼠均表现出发育迟缓、肢体麻痹等症状;另外在感染后第5d,与野生型乳鼠相比,IL-1R1~(-/-)乳鼠心脏、肺脏和肾脏组织的CV-A10病毒载量均高于野生型乳鼠,且差异具有统计学意义;通过HE染色分析发现,在感染后期IL-1R1~(-/-)乳鼠的肺组织病变严重程度高于同时期野生型乳鼠。在CV-A10感染中后期IL-1R1~(-/-)乳鼠的细胞因子mRNA转录水平明显升高,然而野生型乳鼠的细胞因子mRNA主要在感染后1-2天呈现一过性增加。综上表明,C57BL/6野生型和IL-1R1~(-/-)乳鼠均对CV-A10病毒易感;与野生型乳鼠相比,IL-1R1~(-/-)乳鼠的组织损伤更严重,特别是肺组织的损伤主要发生在CV-A10病毒感染的中晚期;此外,IL-1R1缺陷小鼠在感染后期的各组织器官中检测到持续性的细胞因子表达。

    2024年02期 v.40 326-336页 [查看摘要][在线阅读][下载 2351K]
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  • 柯萨奇病毒A10型对利巴韦林耐药性的初步研究

    孙甜甜;宗彦君;王蕊;李冀琛;刘莹;李晓亮;韩振志;于力恒;刘志军;孙强;张勇;

    近年来,全国范围内手足口病(Hand, foot, and mouth disease,HFMD)的感染率逐渐上升,其中柯萨奇病毒A组10型(Coxsackievirus A10,CV-A10)是主要病原体之一,利巴韦林是临床上治疗儿童手足口病的常用药物之一。为了评价利巴韦林在体外对CVA10的抑制效果,本研究中,我们随机选取了19条2009-2021年的不同地区和不同年代的有代表性的中国大陆优势流行基因型C基因型的CVA10毒株,通过细胞毒性实验(Cell counting kit-8,CCK8)来检测利巴韦林在RD细胞上对CVA10的抑制率。将抑制率大于85%的CVA10定义为对利巴韦林敏感组,抑制率小于15%的CVA10定义为对利巴韦林耐药组。结果显示利巴韦林在0.78mmol/L浓度下可以对CVA10产生较好的抑制作用并且对细胞的毒性较低。19株CVA10中有4株表现出对利巴韦林耐药性,2株表现出对利巴韦林敏感性,剩余13株的敏感性在85%~15%之间。通过7日龄ICR乳鼠感染实验比较对利巴韦林敏感组和耐药组毒株的致病力差异,通过观察乳鼠临床评分、生存率、体重及组织取材的滴度测定结果均表明对利巴韦林敏感组CVA10在小鼠上的致病力比耐药组强。进一步使用MEGA 7.0软件对影响CVA10复制和翻译的2C区氨基酸序列进行差异性分析,以分析可能的耐药位点。结果显示对利巴韦林耐药组和敏感组CVA10的2C区的327位和328位氨基酸位点存在差异。本研究发现当前国内流行的CVA10存在广泛对利巴韦林耐药现象,其中部分CVA10对利巴韦林完全耐药。因此,有必要加强对CVA10耐药株的监测,以便更好地指导临床医生正确地选择抗病毒药物,为个体化的治疗提供理论依据。

    2024年02期 v.40 337-345页 [查看摘要][在线阅读][下载 1268K]
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  • 柯萨奇病毒A组16型VP1-145位氨基酸变异影响对硫酸乙酰肝素结合能力的初步探究

    宗彦君;孙甜甜;王蕊;刘莹;李冀琛;孙强;刘志军;张勇;

    柯萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus A16,CVA16)与肠道病毒A71型(Enterovirus A71,EV-A71)是国内导致手足口病的重要病原体,二者同源,来自共同祖先,基因组结构相同,并且均使用硫酸乙酰肝素(Heparan sulfate,HS)作为吸附受体。本研究基于EV-A71的VP1-145位氨基酸位点的相关研究结果,分析CVA16的VP1-145氨基酸差异,选取3株中国流行的,在该位点具有差异的CVA16,进行对HS结合能力影响的研究。使用不同浓度肝素酶Ⅰ处理人横纹肌肉瘤(Human rhabdomyosarcoma,RD)细胞,比较不同CVA16株对肝素酶Ⅰ处理前后的RD细胞的吸附能力,以及接种后12h,24h,48h后各毒株在RD细胞的复制情况。结果表明,在使用5mIU/mL和10mIU/mL浓度肝素酶Ⅰ水解RD细胞表面的HS后,VP1-145氨基酸位点为甘氨酸(Glycine,G)的CVA16对RD细胞的吸附能力下降,其下降程度与肝素酶Ⅰ的作用浓度呈正相关,且影响了后续12h,24h,48h病毒在RD细胞中的复制,其差异具有统计学意义(P<0.05)。而VP1-145氨基酸位点为谷氨酸(Glutamic acid,E)的两株CVA16均未观察到此种趋势。为了进一步探究该种结合能力的差异与病毒致病力之间的关系,对三株病毒进行2日龄ICR乳鼠感染实验。通过观察乳鼠生存率、临床评分、体重变化,来评估不同CVA16株在小鼠感染模型中的致病力差异。结果表明,CVA16(VP1-145E)的致病力明显强于CVA16(VP1-145G)。后对三株病毒进行全基因组测序,测序结果显示,除VP1-145位点外,三株CVA16还存在其他的差异位点,故后续我们又通过反向遗传学拯救病毒,对VP1-145位点的作用机制进行了进一步的探讨。本研究结果证实,VP1-145位点的氨基酸变异会影响CVA16与HS的结合能力,145位点为E的病毒,其与HS的结合能力较差,当145位点由E突变至G时,病毒与HS的结合能力增强,其与RD细胞的结合能力受到肝素酶Ⅰ的影响。本研究为CVA16毒力位点与致病机制的研究提供了一定的理论基础。

    2024年02期 v.40 346-356页 [查看摘要][在线阅读][下载 1258K]
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  • 线粒体凋亡参与EV-71感染致人微血管内皮细胞损伤的机制

    李爽;梁若楠;朱培育;纪望全;晋乐飞;段广才;

    肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)是一种嗜神经性肠道病毒,主要通过粪-口途径传播。然而,EV71感染导致微血管内皮细胞凋亡的机制尚未完全阐明。本研究使用临床分离的EV71毒株体外感染人微血管内皮细胞(Human microvascular endothelial cells,HMEC-1),探讨线粒体损伤在EV71感染损伤HMEC-1的作用机制。MTT法检测结果发现,HMEC-1感染EV71 24 h后细胞活力下降到47%(P <0.01);透射电子显微镜观察到EV71感染后的HMEC-1胞质中出现大量空泡,并且可观察到HMEC-1线粒体肿胀、变性并明显空泡化,部分线粒体嵴断裂、减少,少量胞质内可见散在或游离的病毒颗粒;JC-1染色结果显示EV71感染32 h后,HMEC-1线粒体膜电位明显下降;荧光探针DCFH-DA检测到病毒感染后的细胞线粒体活性氧(Reactive oxygen species,ROS)水平明显升高;随着EV71感染时间的增加,EV71-VP1、Cleaved-caspase 3、Cleaved-caspase 8、Cleaved-caspase 9、Bax蛋白水平逐渐升高,并且细胞中的Cyt C蛋白从线粒体转移到了细胞质;此外,实时荧光定量PCR法结果显示,随着感染时间增加,HMEC-1表达TNF-α、IL-6、IL-1β的mRNA表达水平逐渐升高。而通过N-乙酰半胱胺酸干预后,可显著降低病毒感染诱导内皮细胞促凋亡蛋白和TNF-α、IL-6、IL-1β mRNA的表达(P <0.01)。因此,本研究发现EV71感染通过线粒体途径诱导HMEC-1凋亡,且这一过程受ROS介导。

    2024年02期 v.40 357-364页 [查看摘要][在线阅读][下载 1394K]
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  • Ⅲa基因缺失的人7型腺病毒载体系统的建立

    王洋;王永进;侯文哲;郭小娟;郑贵森;邹小辉;

    为了获得既能高效扩增外源基因,又不产生复制型子代病毒的腺病毒载体,我们构建了一个Ⅲa基因缺失的单周期腺病毒载体。本研究在前期已构建的E3区携带绿色荧光蛋白GFP的人7型腺病毒载体pK-Ad7E3GFP基础上进行。首先设计引物扩增包含氨苄青霉素抗性基因和质粒复制起点的AMP-ORI片段,利用限制性内切酶Asc I将pK-Ad7E3GFP切割为29.1kb与7.7kb的大小片段,其中,7.7kb小片段与AMP-ORI片段组装,获得第一个中间质粒pA-Ad7E3GAscI;经重叠延伸PCR、酶切、DNA组装等方法,将pA-Ad7E3GAscI上的Ⅲa基因进行删除,获得第二个中间质粒pA-AscDⅢa;经Pme I酶切的pA-AscDⅢa与上述29.1kb大片段经DNA组装后,得到重组腺病毒质粒pK-Ad7DⅢaE3GFP。同时,构建携带Ⅲa基因的真核表达载体pTPL-Ⅲa,转染293细胞,经G418筛选构建细胞系293-Ⅲa。结果发现,经Pme I线性化的pK-Ad7DⅢaE3GFP质粒转染293-Ⅲa细胞,7d后可见荧光聚集,且逐渐增大,表明重组腺病毒Ad7DⅢaE3GFP拯救成功;提取病毒基因组进行PCR鉴定,结果与预期相符;细胞培养上清经负染后,在电镜下可见腺病毒典型的正二十面体形态,培养细胞中也可见病毒呈晶格排列;以上结果均表明Ad7DⅢaE3GFP拯救成功。本研究成功建立了Ⅲa基因缺失的单周期人7型腺病毒载体系统,为该载体的研究与应用奠定基础。

    2024年02期 v.40 365-373页 [查看摘要][在线阅读][下载 1484K]
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  • 2018-2023年新疆维吾尔自治区风疹流行病学特征及病毒基因特征分析

    玛合木提江·库尔班;钱程;凯赛尔·吾斯曼;孙璐;阿依波塔·孜那西;朱贞;

    为了解2018-2023年新疆维吾尔自治区(以下简称新疆)风疹流行病学特征以及风疹病毒(Rubella virus,RuV)基因特征,本研究整理和汇总2018-2023年新疆风疹发病数据,采集2022年临床标本开展核酸检测和病毒分离,并对分离株进行测序,获得其靶基因序列(位于E1基因的739个靶核酸片段,E1-739)。基于E1-739,将本研究RuV株与WHO基因分型代表株以及已报道的1E和2B基因亚型代表株构建系统发育树,鉴定其基因型/亚型。同时,与同时期我国其他省份流行RuV代表株进行比对,了解新疆流行RuV的分子差异。结果显示,2018-2023年,新疆共计报告风疹病例599例,除外2019年风疹发病有小幅回升(414例,1.66/10万),其余年份发病率均维持在较低水平(年均发病率为0.17/10万),并在2023年降低到了历史最低水平(8例,0.03/10万);2018-2023年间,病例主要集中在北疆的阿勒泰和塔城等地区;病例年龄分布显示,2018年和2021-2023年间,<10岁儿童病例占比均较高(52.8%~62.5%),而2019年和2020年则以10-19岁年龄组人群为主(72.4%和51.9%)。病毒学监测数据显示,2022年从新疆4个地(州、市)共获得7株RuV病毒株的靶基因,分属于1E-L2(6株)和2B-L2c(1株),与同期我国其他省份流行的RuV病毒株具有较高的亲缘性。本研究为新疆地区优化风疹防控策略提供了基础科学数据。

    2024年02期 v.40 374-382页 [查看摘要][在线阅读][下载 1236K]
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  • 2012-2023年882例重症手足口病病例病原谱及CV-A6基因特征分析

    路环环;肖金波;严冬梅;冀天娇;杨倩;祝双利;张勇;

    为了解重症手足口病(Hand,foot,and mouth disease,HFMD)病原谱变化情况以及重症HFMD相关柯萨奇病毒A组6型(Coxsackievirus A6, CVA6)的基因特征,本研究收集了2012-2023年各省级HFMD监测网络实验室送检的882份重症HFMD病例病毒分离物,通过扩增病毒的VP1编码区进行分子分型以确定肠道病毒的血清型,并对其中的CVA6进行全长VP1区扩增和核苷酸序列测定分析,进行最大似然法系统进化树和氨基酸置换熵值等生物信息学分析。结果发现,2018年开始,以CVA6和CVA10为主的肠道病毒逐渐取代EV-A71和CV-A16成为导致重症HFMD的主要病原体,在每年检出的病原体中的比例均超过50.0%。除2013年重症HFMD中分离的CVA6属于D2基因亚型外,2013年后重症HFMD中分离的CVA6均属于D3a基因亚型,但2019年以后分离的CVA6序列与以往分离株序列的进化距离明显增大。此外,针对氨基酸位点的置换熵值研究表明,参与构成构象表位的VP1-283易发生突变,该位点从2017年开始由亲水的苏氨酸突变成疏水的丙氨酸,导致其可能分别与VP3-57N、VP3-66R之间形成氢键,这可能会影响到病毒的感染过程。本研究明确了2012-2023年中国重症HFMD病原谱的变化特征,探究了导致重症HFMD的CVA6的进化特点以及重要氨基酸变异特征,为重症HFMD的预防控制策略的制定提供了理论依据。

    2024年02期 v.40 383-391页 [查看摘要][在线阅读][下载 1398K]
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动物病毒研究论著

  • 鸭坦布苏病毒GZSS2022株分离鉴定及其全基因序列遗传进化分析

    安而立;嵇辛勤;阮涌;陈泽辉;曹伟;王晗晗;罗晓宇;龙丹丹;陈佳琪;杨纯培;吴宗豪;王丽娟;姚碧琼;

    本研究从贵州省黔东南地区某麻鸭养殖场采集到疑似感染鸭坦布苏病毒(Duck tembusu virus,DTMUV)病的组织病料,无菌处理后接种于鸡胚连续传代培养,分离到一株病毒,通过RT-PCR、PCR鉴定及透射电镜形态观察确定该分离病毒为DTMUV,命名为GZSS2022株。为了解该分离病毒的遗传变异特点,对该分离病毒进行动物回归实验、PCR扩增及测序其全基因组、在线BLAST比对其全基因组核苷酸同源性并绘制系统发育进化树后再进行遗传进化分析。结果显示:用该病毒感染SPF雏鸭后临床症状与病理剖检基本符合DTMUV感染特征,且在病理切片中可观察到鸭脑部血管渗出淋巴细胞和单核细胞聚集在血管周围形成“血管袖套”这一典型的DTMUV感染现象。GZSS2022株与NCBI上已上传的其他DTMUV参考毒株全基因组核苷酸同源性均在96%以上,其中与广西分离株GXQZ01-2020同源性最高为99.5%,且同属于中国谱系I群毒株,与多数分离于北方地区的中国谱系II群相比,具有明显流行地域性。本次所分离的DTMUV及其全基因组序列分析结果以期为坦布苏病毒地域性流行情况与该病毒遗传变异情况的研究提供参考。

    2024年02期 v.40 392-401页 [查看摘要][在线阅读][下载 1512K]
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植物病毒研究论著

  • 侵染贵州番茄的辣椒褪绿病毒分子鉴定与分析

    田雨;李淳;吴石平;黄露;安星宇;王莉爽;

    辣椒褪绿病毒(Capiscum chlorosis virus, CaCV)是正番茄斑萎病毒属(Orthotospovirus)的重要成员,能够侵染辣椒、番茄等作物并造成严重危害。为明确贵州番茄CaCV分离物基因组分子结构特征及其进化起源,本研究通过RT-PCR技术扩增和测定了CaCV的N、NSs和NSm基因的全长片段,分别获得长度约828bp、1 320bp和927bp的目标条带。经过序列比对和进化树构建等方法进行遗传进化分析发现,贵州番茄CaCV分离物的N、NSs和NSm基因与CaCV其他分离物核苷酸的相似性分别在85.5%~99.4%、82.7%~98.9%和83.1%~98.7%之间。根据系统发育树结果,贵州番茄CaCV分离物N基因和NSs基因与中国云南分离物的亲缘关系较近,NSm基因与中国海南和广州分离物的亲缘关系近,推测贵州CaCV可能是由于番茄、辣椒的品种引进,及蓟马带毒传播进入。这是贵州省CaCV侵染番茄的首次报道,对监测CaCV在我国的扩散具有重要意义。

    2024年02期 v.40 402-411页 [查看摘要][在线阅读][下载 1885K]
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短篇论著

  • 菏泽市2016-2021年乙型B-Victoria系流感病毒全基因组测序分析

    雷霁;李晓寒;李靖;

    为了解2016-2021年菏泽市B-Victoria系流感病毒的遗传突变机制,掌握流感病毒的分子进化规律以及流感疫苗的研发提供依据。选取菏泽市2016-2021年B-Victoria系流感病毒毒株16株,利用二代Ilumina MiSeq测序得到全基因组顺序,利用生物信息学软件构建体系进化树,解析HA和NA基因组的突变规律。16株流感病毒可分成四个进化分支,2株毒株(2016年)隶属V1A进化分支,8株毒株(4株2019年,4株2020年)隶属V1A.3进化分支,4株毒株(2021年)隶属V1A.3a.1进化分枝,2株毒株(2021年)为V1A.3a.2进化分枝。以疫苗株B/Brisbane/60/2008为标准株,HA基因中共有16个位点出现突变,其中有10个位点设在抗原决定簇上。NA基因变目前已有21个位点出现了突变,在关键耐药位点上还未监测到变异。糖基化位点分析结果显示,2021年病毒株HA基因与其他病毒株相比少一个糖基化位点197NET,NA基因组糖基化位点并没有改变。结果提示2019年和2021年菏泽市BVictoria系流感病毒HA基因可能发生了抗原漂移,但所有毒株NA基因突变均未涉及到耐药位点突变,表明菏泽市B-Victoria流感的NA基因耐药性尚未发生改变。

    2024年02期 v.40 412-417页 [查看摘要][在线阅读][下载 1112K]
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  • 咸阳市2018-2022年柯萨奇A组16型病毒序列分析

    王士峰;秦龙;李珍妮;王丽娟;张丹霞;蒋宇婷;

    本研究旨在了解咸阳市2018-2022年手足口病(Hand, foot and mouth disease, HFMD)病原柯萨奇A组16型(Coxsackievirus A16, CV-A16)基因进化特征,为HFMD防控策略制定提供依据。首先分析2018-2022年咸阳市HFMD监测数据,再选取部分CV-A16阳性样本进行RT-PCR扩增VP1基因序列,测序后进行系统进化和序列相似性分析。2018-2022年咸阳市CV-A16阳性确诊病例共计402例,占实验室确诊病例总数的28.69%(402/1401)。VP1序列系统进化分析显示选取的54条CV-A16 VP1均为B1基因亚型,25条属B1a型,29条属B1b型。2018-2020年以B1b型为主,而2021-2022年主要为B1a型。氨基酸序列相似性分析表明,B1a型序列存在T164K(25/25)、I251V(25/25)和A22T(3/25)三处突变,而B1b型主要有N14S(9/29)和I235V(6/29)突变。CV-A16为咸阳市2018年、2019年、2021年和2022年HFMD主要致病原之一,2021年后优势毒株可能已由B1b型转化为B1a型,将来应加强CV-A16基因型动态监测。

    2024年02期 v.40 418-423页 [查看摘要][在线阅读][下载 1093K]
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人类病毒综述

  • 自组装颗粒化新冠疫苗研究进展

    汪晨;尹一凡;林敏;赵小蒙;郑子峥;夏宁邵;张军;

    自组装纳米颗粒作为抗原展示平台可以有效增强抗原的免疫效果和稳定性,是有前景的疫苗技术。新冠疫情加速了颗粒化新冠疫苗的发展,目前已有一些应用纳米颗粒的新冠疫苗处于不同的临床试验阶段。本文介绍了几种自组装颗粒化抗原展示平台在新冠疫苗中的应用,并对其免疫机制和研究进展进行了综述。

    2024年02期 v.40 424-431页 [查看摘要][在线阅读][下载 1084K]
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  • 应当引起关注的昆虫细胞中的弹状病毒污染

    魏佳琪;孙振;薛秀;孟子燕;于馨;刘洋;张建龙;姜琳琳;张兴晓;朱洪伟;于佳玉;

    Sf弹状病毒(Sf-rhabdovirus,Sf-RV)是2014年从雌性草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda,Sf)蛹中分离得到的昆虫细胞系(Sf)中发现的一种弹状病毒,为线性负义单链RNA病毒。在Sf细胞系中发现的新弹状病毒(Sf-RV)使人们对昆虫细胞杆状病毒表达载体系统(Insect cell baculovirus expression vector system,IC-BEVS)生产的生物制剂的安全性表示质疑。本文主要对该病毒基因组构成、组成蛋白功能、感染宿主细胞能力宿主细胞对病毒的影响以及病毒带来的潜在安全性问题等方面进行简要阐述,以增加人们的认识。

    2024年02期 v.40 432-437页 [查看摘要][在线阅读][下载 1154K]
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动物病毒综述

  • 犬腺病毒基因组结构和功能的研究进展

    刘禹含;谢军;孟春春;刘光清;巴音查汗·盖力克;李传峰;

    犬腺病毒病是由犬腺病毒(Canine adenovirus, CAV)所引起的病毒性传染病,该病对犬类繁殖业有较强的危害性。CAV分为两个血清型,CAV-1和CAV-2。两种血清型病毒的形态结构和基因组组成高度相似、抗原性紧密相关,然而两种血清型病毒感染犬后产生的疾病表型、组织细胞嗜性和血凝特性等方面存在明显的差异。本文拟从两种血清型病毒的基因组结构及其编码蛋白功能上进行比较分析,以期为两种血清型CAV的生物学特性和致病性差异的研究以及鉴别诊断技术的建立提供参考。

    2024年02期 v.40 438-446页 [查看摘要][在线阅读][下载 1231K]
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