- 魏玉荣;易忠;符子华;马素贞;简子健;胡尔玛西;
为构建人工修饰的狂犬病病毒,首先用人细胞色素C基因替换狂犬病病毒SRV9株基因间隔区中的非必需区域Ψ区并缺失基因组全长cDNA的糖蛋白CD编码区,得到突变型SRV9cDNA质粒。然后,该质粒与表达野生型SRV9四种结构蛋白N、P、G和L的质粒共转染BHK-21细胞。免疫荧光试验显示转染细胞中有大量特异性荧光,电子显微镜观察可见大量典型的狂犬病病毒粒子。上述结果表明已成功地拯救出了人工修饰的狂犬病病毒。狂犬病病毒SRV9突变株的成功构建与拯救,为新型狂犬病减毒活疫苗的研究提供了重要的实验工具。
2010年05期 v.26 345-350页 [查看摘要][在线阅读][下载 396K] [下载次数：171 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：245 ] - 曹蕾;唐青;陶晓燕;黄莹;杜加亮;张守峰;扈荣良;
利用分子克隆的方法,将CVS-11株狂犬病毒N基因片段克隆入杆状病毒穿梭载体Bacmid中,构建出含CVS-11 NP基因重组杆状病毒表达质粒Bacmid-N;脂质体介导Bacmid-N转染Sf9昆虫细胞获得表达CVS-11 NP的重组杆状病毒(AcMNPV-N)。用ELISA、FA、SDS-PAGE和Western-blot法对表达产物进行鉴定和分析,证实CVS-11 NP为胞内表达,且具有天然核蛋白良好的免疫反应性,为进一步研制高效、敏感的狂犬病病毒检测试剂和建立实验室检测方法奠定基础。
2010年05期 v.26 351-356页 [查看摘要][在线阅读][下载 324K] [下载次数：252 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：6 ] |[阅读次数：308 ] - 王海岩;刘昆;陶泽新;李岩;刘桂芳;刘尧;冯蕾;樊庆莹;杨赫;宋立志;徐爱强;
为明确源自急性弛缓性麻痹(AFP)病例的HEV-B组病毒山东地方株的基因型分布,探讨其优势基因型的变迁与疾病暴发之间的关系,本研究对山东省1994年~2008年AFP监测系统分离到的HEV-B组病毒进行了VP1区核酸扩增和序列测定。序列测定结果显示HEV-B山东地方株共包括29种基因型,其中CVA 1种(CVA9),CVB 5种(CVB1~5),ECHO 20种以及新型肠道病毒EV73、75、97。其中ECHO11、CVB3、ECHO6、ECHO14、ECHO25是AFP监测系统中最常分离到的B组病毒。同源性比较显示,相同血清型HEV-B山东地方株型内核苷酸同源性最小75.4%,最大99.6%,与原型株核苷酸同源性最小73.8%,最大85.2%,但氨基酸变异不大。研究表明,不同基因型病毒具有不同的时间循环模式,相同基因型毒株内部根据其遗传距离的远近又可划分为不同的基因亚型,从而帮助确定HEV的传播途径和传播范围。
2010年05期 v.26 357-362页 [查看摘要][在线阅读][下载 563K] [下载次数：223 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：29 ] |[阅读次数：360 ] - 李岩;刘尧;王海岩;陶泽新;宋立志;刘桂芳;冯蕾;冯艺;林小娟;杨赫;樊庆莹;徐爱强;
C组肠道病毒(Human enterovirus C,HEV-C)共包括18个血清型,通过使用现有的组合血清进行中和试验的方法难以鉴定它们的型别。为探讨HEV-C山东地方株的基因型分布及分子进化特征,本研究对1994年~2008年急性弛缓性麻痹(Acute flaccid paralysis,AFP)监测系统中分离到的未定型的毒株,采用HEV-C VP1完整编码区的特异性引物,进行逆转录-聚合酶链反应(Reverse transcriptase-polymerase chain reaction,RT-PCR),产物进行序列测定后,通过NCBI服务器中BLAST程序进行型别鉴定,并与其他HEV-C各基因型代表株进行比较并构建系统发生树。共获得12株HEV-C山东地方株,分别属于4个基因型:CA20、CA21,CA24和EV96。各基因型内山东地方分离株跟原型株相比基因序列同源性较低,系统发生学分析显示HEV-C山东地方株各血清型与原型株亲缘关系较远,提示山东省存在不同基因特征的HEV-C传播。
2010年05期 v.26 363-367页 [查看摘要][在线阅读][下载 357K] [下载次数：161 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：7 ] |[阅读次数：447 ] - 丁晓华;张帆;蔡红斌;杨占秋;
研究中国湖北地区宫颈癌患者的人乳头瘤病毒16型E6和E7的变异以及HPV16变异体的分布。从宫颈癌患者手术切除标本提取组织DNA,用HPV16 E6和E7特异性引物进行PCR扩增,对扩增的部分E6和E7产物片段进行测序分析。在80例宫颈癌组织DNA中有41例发生E6基因178位核苷酸的突变,突变频率58.75%,相应核苷酸改变为Asp-Glu,E7 647在31例测序样品中有22例发生核苷酸序列A到G改变,使29位氨基酸由Asn变为Ser,突变频率70.97%,结果显示在E6和E7基因的178位和647位核苷酸存在高频率的碱基变异。对E6和E7基因的进化树分析表明,中国湖北地区流行的HPV16病毒株主要为亚洲型变异体(As),其次为欧洲型(E),没有发现非洲-1型(Af-1),非洲-2型(Af-2)和亚洲美洲型(AA)HPV16变异体,中国湖北地区流行的As变异体是否有更高的致宫颈癌的风险还有待于进一步对不同阶段CIN和正常宫颈上皮样品的E6和E7基因进行序列分析和对变异体蛋白进行功能研究。
2010年05期 v.26 368-372页 [查看摘要][在线阅读][下载 227K] [下载次数：158 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：8 ] |[阅读次数：335 ] - 岳锦亚;吴新伟;伍业健;李向忠;蒋力云;李巧艳;李磊;杨霞;
为了研究RNA干扰(RNAi)对Ⅰ型登革病毒(DENV-1)在白纹伊蚊C6/36细胞内复制的影响,本研究设计并合成针对I型登革病毒Pr M基因的小干扰RNA,以脂质体法转染入C6/36细胞后,用DENV-1感染已转染的细胞,观察细胞病变效应,MTT法检测细胞存活率,荧光定量RT-PCR检测登革病毒RNA含量。结果表明:转染siRNA的C6/36细胞在受登革病毒攻击7天后仍无明显细胞病变效应,细胞存活率比对照组提高2.26倍,细胞内登革病毒RNA拷贝数比对照组降低约97.54%。说明利用RNA干扰技术能有效抑制登革病毒核酸在C6/36细胞内复制,并对细胞具有一定保护作用,为登革热的防治提供了新的思路。
2010年05期 v.26 373-378页 [查看摘要][在线阅读][下载 532K] [下载次数：319 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：5 ] |[阅读次数：342 ] - 王衍海;赖植发;顾金保;
根据人β-球蛋白基因第一内含子5′-端供位序列与免疫球蛋白重链可变区基因3′-端受位序列构建人工内含子,将人工内含子插入重组蚊浓核病毒质粒载体p7NS1-GFP中GFP融合表达的病毒非结构蛋白NS1的编码框内,构建成载体p7NS1-Intron-GFP,与辅助载体pUCA共转染蚊C6/36细胞系,荧光显微镜下观察细胞内GFP的表达情况。纯化、回收共转染后形成重组病毒与野生病毒,共感染白纹伊蚊二龄幼虫并观察幼虫体内GFP的表达情况。结果在C6/36细胞与蚊幼虫体内均观察到GFP的高效表达,证实人工内含子无论在蚊细胞系内还是在活体幼虫内均可正常行使其自我剪切的功能,未影响到下游蛋白GFP的表达。本研究为人工内含子在蚊虫细胞内的应用奠定基础,为蚊虫及其病原体相关基因工程技术提供新的策略。
2010年05期 v.26 379-384页 [查看摘要][在线阅读][下载 522K] [下载次数：116 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：328 ] - 何雷;张彦明;徐彦召;唐青海;王静;杨小云;代晨;向华;常鹏祥;林鸷;
为研制猪瘟活载体疫苗,构建共表达猪瘟病毒E2基因和猪白细胞介素2基因的重组腺病毒并研究其免疫原性。应用PCR方法从pMD19-T-E2质粒和pMD19-T-pIL2质粒中分别扩增E2基因和pIL-2基因,将扩增的全长E2基因和pIL-2的编码区基因序列通过柔性接头序列(5个甘氨酸密码子)串联,插入腺病毒穿梭载体AdTrack中,在受体菌中与骨架载体AdEasy同源重组。重组质粒AdEasy-E2-pIL-2转染HEK293细胞,包装出重组腺病毒rAd-E2-pIL-2。用rAd-E2-pIL-2免疫家兔,经兔体交互免疫试验评定其免疫效果。结果显示,经RT-PCR和West-ern blot检测,成功构建了rAd-E2-pIL-2,重组病毒滴度达108.12PFU/mL。rAd-E2-pIL-2接种家兔后刺激接种兔产生猪瘟病毒特异性抗体,淋巴细胞转化试验结果显示猪瘟病毒诱导兔淋巴细胞特异性增殖,攻毒后rAd-E2-pIL-2接种兔和猪瘟病毒C株接种兔均未出现定型热反应。研究结果表明,rAd-E2-pIL-2免疫兔可以预防猪瘟病毒C株接种引发的体温反应,rAd-E2-pIL-2可望成为猪瘟候选疫苗。
2010年05期 v.26 385-391页 [查看摘要][在线阅读][下载 530K] [下载次数：427 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：15 ] |[阅读次数：402 ] - 刘华雷;吕艳;郑东霞;赵云玲;孙承英;张维;李金明;王志亮;
流感病毒M2蛋白五个关键位点氨基酸残基(第26、27、30、31和34位)中的任何一个发生突变都会导致抗流感病毒药物中金刚烷胺抗药性的产生。本研究利用焦磷酸测序技术对94株不同亚型禽流感病毒金刚烷胺耐药性分子决定区进行了鉴定,并进行抗药性分析。结果表明94株禽流感病毒中有81株M2基因存在金刚烷胺耐药性的分子标签,其余的13株根据分子标签判断为对金刚烷胺敏感。耐药性的分子标记存在V27I和S31N两种突变形式,其中绝大多数为S31N。
2010年05期 v.26 392-395页 [查看摘要][在线阅读][下载 196K] [下载次数：178 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：4 ] |[阅读次数：426 ] - 路伟;张秀华;王秀东;武华;
2006年从辽宁省某猪场采集具有流感症状猪鼻拭子共30份,经9~11日龄SPF鸡胚分离,对分离株进行了血凝试验、血凝抑制试验、RT-PCR亚型鉴定,全基因序列比对和接种试验动物试验。结果表明:该毒株具有凝集0.5%鸡红细胞的活性,且与抗猪流感H1标准血清发生血凝抑制反应,RT-PCR分别扩增得到全基因8个片段,利用DNAStar生物学软件进行序列分析,HA基因与GenBank登录的H1~H16中的H1基因序列同源性最高,NA基因与N1~N9中的N1基因序列同源性最高,故该LN株分离毒为猪流感H1N1亚型病毒。全基因序列中,除了M基因不是猪源的,其它基因片段均与国内H1N1亚型猪流感参照株高度同源,推测LN株可能是由类人和类禽谱系的流感病毒与古典猪谱系的流感病毒重排形成的;用该病毒接种试验动物可成功复制出猪流感典型症状。该病毒的分离鉴定及全基因组序列分析为我国进一步调查猪流感的流行规律提供了基础数据。
2010年05期 v.26 396-401页 [查看摘要][在线阅读][下载 733K] [下载次数：548 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：6 ] |[阅读次数：307 ] - 张贺楠;齐岩;史伟伟;梁艺瑜;刘红波;曹伟胜;廖明;
从ALV-J中国地方分离株SCAU-HN06株(血管瘤病变型)、NX0101株和JS-nt株(骨髓瘤病变型)病毒的细胞培养物提取前病毒DNA,通过PCR扩增各毒株的LTR并克隆,随后进行测序分析。与国内外ALV-J参考毒株LTR序列比较发现:国内地方分离株与英国ALV-J原型株HPRS-103和美国ALV-J原型株ADOL-7501的LTR核苷酸序列相似性为88.0%~97.2%;LTR中的U5区及R区具有较高的保守性,而U3区内存在较大差异。将不同病变型ALV-J的LTR片段分别插入pCAT-basic载体CAT报告基因5'端。用所得的重组报告基因表达质粒转染DF-1细胞,48h后通过测定转染细胞中的CAT表达量来评价LTR启动子的活性。结果表明,SCAU-HN06株与骨髓瘤病变型ALV-J(JS-nt株,NX0101株)LTR启动子活性差异不显著。
2010年05期 v.26 402-406页 [查看摘要][在线阅读][下载 488K] [下载次数：303 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：13 ] |[阅读次数：312 ]