病毒检测方法研究专题论著

  • 新型冠状病毒假病毒的制备及血浆中和抗体检测

    伍政宇;罗楚铭;贾婷婷;舒跃龙;

    新型冠状病毒(SARS-CoV-2)引发新型冠状病毒肺炎(COVID-19)全球大流行。由于SARS-CoV-2生物安全管理的要求,高效制备获得高滴度的新型冠状病毒假病毒对基于S蛋白研发疫苗、中和抗体、病毒入侵抑制剂药物以及人群血清学调查等十分重要。本研究基于慢病毒系统,对制备新型冠状病毒假病毒过程中的重要参数进行优化,用Western Blot检测假病毒S蛋白和p24蛋白的表达及假病毒包装情况,用荧光素酶报告系统检测假病毒感染入侵效率。利用制备好的假病毒对恢复期血浆的中和抗体水平进行检测。结果显示骨架质粒与野生型Spike质粒为2∶1比例,在转染后48h收集上清为SARS-CoV-2野生型假病毒包装的最佳条件。与野生型相比,恢复期血浆对四种突变株的中和抗体滴度均降低,对B.1.351株中和能力最弱,B.1.617.2株其次,重型患者恢复期血浆对野生型和突变株的中和抗体滴度高于轻型与普通型患者。本研究优化了新型冠状病毒假病毒包装的实验室条件,评估了COVID-19患者恢复期血浆对野生型及四种突变株的中和抗体水平,提示未来对突变株的免疫逃逸进一步加强监测的重要性。

    2022年03期 v.38 513-522页 [查看摘要][在线阅读][下载 1214K]
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  • HBV-DNA试剂盒检测下限及线性范围下限精密度的性能评估

    陈笑;谢垚;张苗;姚莎莎;

    针对某厂家乙型肝炎病毒核酸(Hepatitis B virus nucleic acid,HBV-DNA)定量测定试剂盒声明的检测下限及线性范围下限的批内精密度进行补充评估,以保证检验结果的可重复性以及检验报告的准确性。参照CNASGL037《临床化学定量检验程序性能验证指南》、CNAS-GL039《分子诊断检验程序性能验证指南》以及中华人民共和国医药行业标准YY/T 1182-2010《核酸扩增检测用试剂(盒)》,基于ABI STEPONE PLUS实时荧光定量PCR仪检测某厂家HBV-DNA定量测定试剂盒声明的检测下限浓度(30 IU/mL)和线性范围下限浓度(100 IU/mL)的临床血清样本,进行相关性能评估。本次评估结果显示检测下限浓度为50 IU/mL(20次检测结果检出率≥90%),线性范围内最低检测浓度水平为300 IU/mL(变异系数CV<5%),与某厂家HBV-DNA定量测定试剂盒申明的检测下限不相符,批内CV<5%不能覆盖整个线性范围,故本实验室根据评估结论完善了HBV-DNA定量测定结果的审核规则,以保证检验结果的可重复性以及检验报告的准确性,为临床提供更有效的服务。

    2022年03期 v.38 523-527页 [查看摘要][在线阅读][下载 935K]
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  • 新型冠状病毒突变株Omicron核酸检测的TaqMan探针设计

    张嫦丽;伍嘉豪;易华伟;

    Omicron(奥密克戎)作为最新的新型冠状病毒(SARS-CoV-2)突变株,其带有大量的突变位点,且突变位点主要位于S蛋白上,这不仅会增加再次感染病毒的风险,同时也会大幅降低疫苗和抗体疗法的的效果。Omicron携带的突变虽不影响国内现使用的核酸检测试剂,但这些检测试剂不能有效地鉴别出Omicron突变株。本研究通过对Omicron以及其他SARS-CoV-2突变株的基因序列进行分析,设计了能特异性检测Omicron突变株的TaqMan探针。同时,该探针可与现有的核酸检测体系进行结合,实现SARS-CoV-2核酸检测和Omicron突变株鉴别的双重功能。

    2022年03期 v.38 528-533页 [查看摘要][在线阅读][下载 1107K]
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人类病毒研究论著

  • 鸢尾苷元磺酸钠对柯萨奇B3型病毒诱导细胞固有免疫的初步研究

    郑晓涵;周静;袁明铭;王媛;张磊;

    柯萨奇B组3型(Coxsackievirus B3,CVB3)病毒目前仍严重危害人类健康,目前没有批准的用于CVB3治疗的特效药,亟需开发新的抗CVB3药物。鸢尾苷元磺酸钠(Tectorigenin sodium sulfonate,TSS)是中药川射干化学成分鸢尾苷元的修饰物,本研究应用细胞感染模型评估了TSS体外抗CVB3作用。实验中,以CVB3感染的HT-29细胞为体外模型,在最大无毒浓度(TC0)情况下观察不同浓度药物作用于HT-29细胞后,在72h收集细胞,采用相对荧光定量RT-PCR法检测细胞中CVB3病毒核酸量,TLR3、TRIF mRNA表达水平;收集上清液,采用ELISA法测定上清液NF-κB,TNF-α、IL-6、IFN-β含量。结果显示TSS对HT-29细胞的TC0为15.625μg/mL。与模型组比较,15.625μg/mL剂量的鸢尾苷元磺酸钠能有效增加HT-29细胞活性,降低CVB3病毒滴度(P<0.001),能明显降低细胞内转导和转录活化因子TLR3、TRIF、NF-κB的表达水平(P<0.05),降低炎症因子TNF-α、IL-6、IFN-β的含量(P<0.05)。以上结果表明TSS体外具有显著的抗柯萨奇B3病毒作用,其机制可能是通过调节TLR3/NF-κB免疫信号转导通路而发挥抗病毒作用。

    2022年03期 v.38 534-542页 [查看摘要][在线阅读][下载 1794K]
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  • 利用马赛克策略设计靶向神经氨酸酶抗原的广谱流感疫苗

    李瑞婷;李敏超;李彦君;舒跃龙;孙彩军;

    季节性流感病毒仍对全球公共卫生安全构成巨大威胁,对老人、儿童以及免疫功能低下人群的危害尤其严重。疫苗接种是目前应对季节性流感疫情重要手段,然而由于抗原转换和抗原漂移,常出现疫苗株与实际病毒流行株的不匹配现象,因此迫切需要开发一种安全高效的广谱流感疫苗来对抗季节性流感病毒和潜在的流感大流行。抗原设计是研发新型疫苗的关键前提,我们利用马赛克(mosaic)遗传算法设计研发了一种具有广谱抗原表位覆盖率的靶向流感病毒神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)的新型抗原(Mosaic-NA)。该抗原在最大程度上涵盖了所有已报道甲型流感病毒的NA1蛋白与NA2蛋白序列中的细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocyte,CTL)抗原表位,并保留了天然蛋白空间构象。因此,这种新型抗原预期可有效诱导出靶向保守表位的CTL反应和抗体反应,从而为研发通用流感疫苗提供新思路和理论基础。

    2022年03期 v.38 543-553页 [查看摘要][在线阅读][下载 1790K]
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  • 高致病性H7N9禽流感病毒神经氨酸酶R292K、E119V突变型耐药株感染MDCK细胞转录组学研究

    唐静;张曙霞;张靖;李希妍;刘佳;王大燕;

    人感染高致病性H7N9禽流感病毒(Highly pathogenic avian influenza H7N9,HPAI H7N9)神经氨酸酶抑制剂(Neuraminidase inhibitors,NAIs)耐药株在哺乳动物细胞中适应性较好,是其导致病死率高的原因之一。本文研究HPAI H7N9耐药株对流感病毒敏感细胞MDCK细胞转录的影响。用0.1 MOI含NAIs耐药突变位点(NA R292K,E119V)的HPAI H7N9重组病毒及其敏感株感染MDCK细胞,于感染后0h、7h和24h取样,进行RNA测序并分析。结果三株病毒感染细胞0h和7h时,各组差异表达基因(Differentially expressed genes,DEGs)较少。24h时敏感株、R292K株和E119V株感染后的DEGs均显著增加,数量相似,分别为10 508、10 663和10 711,其中三者共同DEGs为83%~85%,每组特有DEGs为3%~8%。3株病毒感染细胞24 h时DEGs涉及的KEGG通路分类及各通路下基因个数及所占比例均较相似,且3者前20条KEGG通路中多数(11条)通路相同。结果说明,含R292K或E119V耐药突变位点的HPAI H7N9病毒与其敏感株相似地能在MDCK细胞中引起较强烈的转录改变并影响细胞代谢及免疫通路。

    2022年03期 v.38 554-562页 [查看摘要][在线阅读][下载 1429K]
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  • 福建省2012-2020年麻疹野毒株分子流行病学分析

    张苏晗;杨秀惠;陈致飞;李东;郑凝旋;尤娜;

    为了解2012-2020年福建省麻疹野毒株病毒核蛋白N基因及H基因的变化,探讨其流行规律,本研究收集2012年-2020年福建省各地市级麻疹风疹网络实验室检测麻疹病毒核酸阳性的麻疹疑似病例咽拭子标本开展病毒分离,应用RT-PCR方法扩增MV的N基因羧基末端450个核苷酸片段并进行序列测定,通过与WHO推荐24个麻疹病毒基因型参考株、中国S(Shanghai,上海)191疫苗株、H1a中国代表株(China93-2)进行对比分析,从2012-2020年共收到1217例麻疹核酸检测阳性的疑似麻疹病例的病原学标本中,共分离出83株麻疹病毒野毒株,其中76株为H1a亚型,5株B3基因型,2株D8基因型。H1a亚型可分为2个独立谱系Lineage1~2,MV H1a基因型毒株间核苷酸及氨基酸同源性为99.82%~99.98%和99.91%~100%。2018年及2019年福建省首次分离到B3基因型麻疹病毒及D8基因型麻疹病毒为输入性基因型,B3基因型毒株高度同源,D8基因型毒株同源性100%。H1a基因型为福建省本土野毒株优势基因亚型,不同地区不同年代存在同一野毒株持续循环,同一地区同一年份也具有不同的传播链。从83株麻疹野毒株中随机选择51株进行H基因全长序列(1 854bp)进行序列测定。根据H基因序列的亲缘性关系图,51株野毒株的核苷酸和氨基酸之间的同源性为97.24%~98.01%和97.53%~98.64%。与S191疫苗株相比,在氨基酸200位点N天冬酰胺→D天冬氨酸,240位点S丝氨酸→N天冬酰胺,导致潜在糖基化位点的改变,但重要的氨基酸功能位点仍高度保守,目前我国使用的麻疹疫苗对流行麻疹野毒株仍有效果,仍需加强输入型麻疹病例的监测,避免造成本地传播。

    2022年03期 v.38 563-572页 [查看摘要][在线阅读][下载 1114K]
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  • 柯萨奇病毒A组4型生物化学特性及免疫原性分析

    田宇璇;魏真妮;安欢欢;吴杰;申硕;

    对引起手足口病的肠道病毒A组4型进行生物化学特性及免疫原性的研究。利用大肠杆菌表达结构蛋白全长或部分片段的GST融合蛋白,纯化CV-A4病毒颗粒,制备兔抗CV-A4 VP1~VP4蛋白及抗CV-A4病毒颗粒抗血清。以免疫印迹法(Western blotting,WB),结合SDS-PAGE电泳法,对CsCl密度梯度纯化的CV-A4的空心颗粒(EP)与实心颗粒(FP)的蛋白组分、纯度、多聚蛋白酶剪切进行分析。以微量中和法测定以上6种抗原免疫的兔或小鼠血清中和抗体效价,评估免疫原性。WB和间接免疫荧光法证明了抗体特异性。EP由VP0、VP1和VP3构成,而FP的VP0被剪切,故由VP1-VP4构成。EP和FP比例分别为41%和59%。CsCl密度分别为1.26 g/cm3和1.34 g/cm3,纯度分别为70.5%和96.3%。中和试验显示,兔抗全病毒抗体具有中和作用,而兔抗CV-A4VP1~VP4结构蛋白抗体不具有中和作用。免疫原性强弱为:FP>EP>VP1-VP4。本研究建立了CV-A4纯化病毒结构蛋白的分析方法,研究了重组病毒蛋白及2种病毒颗粒的免疫原性及免疫持久性。对包括CV-A4的手足口病多价疫苗的研发策略以及质量控制具重要意义。

    2022年03期 v.38 581-590页 [查看摘要][在线阅读][下载 1253K]
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  • 2018~2020年广西边境地区手足口病流行特征及病原学分析

    冀天娇;居昱;程文隽;陈敏玫;张勇;肖金波;张珂艺;刘宏图;许文波;

    手足口病(Hand,foot and mouth disease,HFMD)是一种由肠道病毒引起的儿童常见传染病,近年来在亚太地区尤其是东南亚地区发生了多起HFMD的大暴发,而我国广西壮族自治区与越南接壤,往来密切。为了解其边境地区HFMD的流行概况和病原学构成,比较该地区病原优势基因型与相邻地区的变异与进化关系。本研究选取与越南接壤的百色、崇左、防城港作为研究对象,收集其2018-2020年HFMD疫情资料进行流行病学分析,并随机采集这三个地市的375份手足口病患儿的临床标本进行荧光定量PCR鉴定,对阳性毒株进行VP1编码区基因扩增及测定,获得的序列与GenBank上下载的各基因型/亚型的代表序列构建系统发生树。结果显示2018-2020年,广西边境地区的报告发病数、重症数、重症比例(重症/发病)和重症率均呈下降趋势,5岁以下儿童为主要发病人群,除2020年以外,其发病流行曲线呈典型的双峰分布。病原谱分析显示,整体上以其他EV为优势循环血清型,且CVA6、CVA16、CVA10和EVA71为该地区的优势病原。同时,2018-2020年期间广西边境流行的EVA71、CVA16、CVA6和CVA10的优势基因亚型分别为C4a、B1b、D3a和C2,且与东南亚临近国家同基因型的流行株具有较近的亲缘关系,提示病毒共同循环进化。而边境地区环境复杂、人员往来密切,因此加强边境地区手足口病的监测及预警系统的建设是西南边境地区手足口病防控的关键。

    2022年03期 v.38 591-599页 [查看摘要][在线阅读][下载 1665K]
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  • EV-A71病毒3D聚合酶突变体的可溶性高效表达纯化及热稳定性分析

    秦博;赵蓉;崔胜;

    RNA依赖的RNA聚合酶是EV-A71病毒进行药物设计的药物靶点蛋白之一,本研究通过已知小核糖核酸病毒科聚合酶同源结构的序列比对,设计了三个针对EV-A71 3D聚合酶,有助于提高核苷酸类似物药物结合效率的突变体,以实验室原有野生型EV-A71 3D聚合酶质粒为模板,通过PCR扩增、野生型质粒的消化分解及转化的方式,构建突变体质粒的阳性克隆,并转化入大肠杆菌3016感受态细胞,通过低温过夜诱导,超声破碎富集的菌泥,将上清经过Ni柱亲和纯化、High trap Q离子交换层析纯化及Superdex 200 10/300凝胶过滤层析三个步骤的梯度纯化,获得了高纯度高产量的EV-A71 3D聚合酶突变体重组蛋白,并通过荧光定量的方法,采用荧光定量PCR仪对最终获得的稳定表达突变体重组蛋白,进行不同溶液条件的荧光热稳定性分析,得到了该重组蛋白最佳的蛋白溶解条件。为深入研究设计以EV-A71 3D作为药物靶点进行核苷酸类似物药物设计提供了技术基础。

    2022年03期 v.38 600-612页 [查看摘要][在线阅读][下载 2554K]
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  • 西安市4起急性胃肠炎疫情中诺如病毒的分子特征分析

    李焱;吴瑞;陈海龙;张辉;刘继锋;冀贞浩;邓杨妮;马超锋;

    诺如病毒(Norovirus,NoV)属于杯状病毒科诺如病毒属,能造成急性肠胃炎暴发,在全球流行广泛,但其在西安市的流行情况不明。为明确2018年10月西安市4起幼儿园急性肠胃炎疫情的病原及其基因特征,本研究采集了患者肛拭子,用实时定量PCR检出诺如病毒阳性核酸,对其扩增部分多聚酶区和衣壳区基因并测序。将所得序列上传分型网站以明确基因型,并用软件分析系统进化、重组位点和正选择位点。共检出GII组阳性核酸31份,测序成功25份。4起疫情均由GII.2[P16]型诺如病毒引起。疫情株扩增序列全长、部分多聚酶区和衣壳区的序列与2018年美国流行株(MK773571)的核苷酸同源性分别为99.8%、99.5%和100%。疫情株与GII.2[P16]型中国参考序列(KY421122、KY806296和MG763377)的核苷酸同源性为99.6%,氨基酸同源性为100%。重组位点约在基因组的5 075bp。疫情株基因组的1 613~1 790aa没有正选择位点。及时的流行病学、分子流行病学研究和全基因组测序对控制诺如病毒相关疫情是必要的。

    2022年03期 v.38 613-619页 [查看摘要][在线阅读][下载 1477K]
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  • 乙型肝炎病毒X蛋白上调环加氧酶2表达促进肝癌细胞增殖的实验研究

    元顺女;朴美花;金丹;

    乙肝病毒X蛋白(Hepatitis B virus X protein,HBx)高表达与乙肝相关肝癌的发病密切相关,但HBx发挥促癌作用的机制并不清楚。环加氧酶2(Cyclooxygenase,COX2)具有促进肝癌细胞增殖的功能,乙肝相关肝癌中COX2的表达增加且与HBx呈正相关,提示上调COX2可能是HBx促进肝癌细胞增殖的分子机制。为了阐明HBx是否通过上调COX2促进肝癌细胞增殖,本实验培养了肝癌HepG2细胞并分为对照组、转染pcDNA3.1-HBx质粒的HBx组、转染NC siRNA的si-NC组、转染NC siRNA及pcDNA3.1-HBx质粒的si-NC+HBx组、转染COX2 siRNA及pcDNA3.1-HBx质粒的si-COX2+HBx组。检测细胞增殖活力OD_(490nm)的水平,COX2、B淋巴细胞瘤2基因(BCL2)、生存素(Survivin)的表达量,前列腺素E2(英文名,PGE2)的含量。实验结果显示,HBx组的OD_(490nm)水平,细胞中COX2、BCL2、Survivin的表达量,培养基中PGE2的含量均高于对照组;si-COX2+HBx组的OD_(490nm)水平,细胞中COX2、BCL2、Survivin的表达量,培养基中PGE2的含量均低于si-NC+HBx组。以上结果表明,HBx促进肝癌细胞增殖的作用部分由上调COX2表达所介导。本实验阐明了上调COX2在HBx促进肝癌细胞增殖中的作用,这为今后研究HBx发挥促癌作用的分子机制以及乙肝相关肝癌的发病机制提供了新思路。

    2022年03期 v.38 620-626页 [查看摘要][在线阅读][下载 1072K]
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  • 甲型肝炎病毒H_2快速复制株在人二倍体细胞中的增殖研究

    王东宝;马忠飞;刘泽;宋盛波;卢志敏;施红进;何陆涛;李燕;李卫东;廖国阳;

    研究甲型肝炎病毒H_2快速复制株在人二倍体细胞中的生长特性,并缩短甲肝病毒的培养周期。将甲型肝炎病毒H_2株感染人二倍体细胞(KMB17细胞株),采用高病毒感染复数(MOI)将病毒培养时间从26d缩短至10d后收获病毒,并通过连续传代进行适应研究,建立H_2株快速复制毒种库,在不同培养时间检测病毒抗原、感染性滴度,绘制病毒生长曲线,进行传代稳定性验证和病毒形态学的观察。甲肝H_2株快速复制病毒株在KMB17细胞上培养10d后收获,连续传代从第5代至第9代,抗原含量均在512~2 048之间,感染性滴度均在8.33 lgCCID_(50)/mL±0.125lgCCID_(50)/mL,H_2株快速繁殖至5代病毒和9代病毒在电镜下观察到多为成熟的实心颗粒。在5批次的重复试验中,病毒培养至10d、16d、22d时,收获的病毒感染性滴度无显著差异(P>0.005)。筛选后的甲型肝炎病毒H_2株的快速复制株缩短了甲肝病毒的培养时间,且保持较好的稳定性和重复性,具有重要的应用价值。

    2022年03期 v.38 627-634页 [查看摘要][在线阅读][下载 1551K]
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  • 2020年7月至2021年5月广州地区儿童脑炎的流行病学和病因学研究

    谢思钿;梁万莉;赵明奇;文思敏;汪亮亮;朱冰;舒跃龙;

    为了解广州地区儿童脑炎的临床症状、病因类型、流行病学特点,评估儿童的临床指标与脑炎严重程度的关系,本研究选取2020年7月至2021年5月于广州市妇女儿童医疗中心神经内科因脑炎住院且年龄<18岁的儿童作为研究对象,通过医院病案系统回顾性收集患儿的临床资料和病原体检测信息进行统计学分析。结果显示,脑炎患儿最常见的症状为发热,其次为抽搐。广州地区儿童脑炎最常见的类型是感染性脑炎,以单纯疱疹病毒感染最为常见,并且存在季节性流行趋势,发病人数在春季达到高峰。此外,肺炎支原体是引起感染性脑炎的第二大病原体。细菌感染多发生在1岁以下儿童,以大肠埃希菌和肺炎链球菌为主,但仍有一半以上的儿童不能明确病因。年龄<1岁的儿童住院时间最长,但1岁~4和≥5岁脑炎患儿的住院时间无统计学差异。发热或伴有支气管肺炎的患儿住院时间相对较长;细菌性脑炎患儿的住院时间最长,但自身免疫性脑炎和病毒性脑炎患儿的住院时间不存在统计学差异。因此,本研究初步了解了广州地区儿童脑炎的病因构成以及常见病原体的流行特点,未来还应加强感染性脑炎的流行病学和病原学监测,研发新的病原体检测技术,从而有效的降低儿童脑炎的发生。

    2022年03期 v.38 635-643页 [查看摘要][在线阅读][下载 1334K]
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  • 陕西省9株乙脑病毒的分离及E基因序列分析

    刘晓宇;王艺楠;胡伟军;殷启凯;张少白;王环宇;

    分析陕西省分离的9株乙脑病毒基因组序列特征。使用乙脑病毒全基因组序列测定引物进行RT-PCR扩增,扩增产物进行测序,拼接后获得基因组序列。利用MEGA 4.1、MegAlin、MEGA7.0等软件进行毒株的系统进化分析,并与P3株、减毒活疫苗SA14-14-2株及覆盖5个基因型别的其他乙脑病毒进行E基因序列比对。9株分离株3株分离自猪舍、6株分离自羊舍,其中4株获得全基因组序列,5株测得E基因序列。基于E基因序列进行毒株核苷酸、氨基酸同源性比较,结果显示分离株均与基因I型GI-b亚型毒株核苷酸和氨基酸同源性最高,核苷酸同源性范围为96.5%~99.7%、氨基酸同源性范围99.2%~100.0%;与SA14-14-2株核苷酸同源性范围为87.5%~88.9%、氨基酸同源性范围96.3%~97.2%;与P3株核苷酸同源性范围为87.6%~88.1%、氨基酸同源性范围96.7%~97.6%。分析09年(陕南地区)分离株与18年(关中地区)分离株的E基因核苷酸差异率为1.8%~2.9%、氨基酸差异率为0%~0.8%。陕西省自然界中循环的乙脑病毒以基因Ⅰ型为主,与P3株在抗原毒力关键位点无差异,病毒相对保守。病毒分子生物学特征及分离生境提示我省需注意多种类乙脑传播媒介和宿主的防控。

    2022年03期 v.38 644-651页 [查看摘要][在线阅读][下载 1833K]
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  • 基于CRISPR/Cas9系统建立SNX11基因敲除A549细胞系

    刘铁柱;李阿茜;李川;梁米芳;王世文;

    为了建立SNX11基因稳定敲除A549细胞系,本研究通过构建针对人SNX11基因的特异性打靶慢病毒载体,将该慢病毒感染A549细胞系,使用嘌呤霉素对慢病毒感染阳性的A549细胞进行筛选,利用梯度稀释法获得单细胞并扩增培养,提取细胞基因组DNA,PCR扩增后进行测序验证,同时提取细胞蛋白后利用Western Blot方法进行蛋白敲除验证,最后进行细胞活性检测和脱靶效应评估。最后,本研究获得了一株SNX11基因敲除A549细胞系;通过脱靶效应评估,结果显示最可能的20个脱靶位点均不存在脱靶现象;该基因敲除对细胞增殖活性没有影响。本研究成功构建了一株SNX11基因敲除A549细胞系,为SNX11蛋白的功能研究建立了细胞模型。

    2022年03期 v.38 652-657页 [查看摘要][在线阅读][下载 1253K]
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  • 水痘-带状疱疹病毒ORF7蛋白原核表达及单抗制备

    尹婷;姜雪鸥;郭静;袁琳;范丽丽;李晴;陈子杨;常军亮;张夫坤;

    水痘-带状疱疹病毒(Varicella-zoster virus,VZV)减毒活疫苗株(V-Oka)为混合毒株,仍具备感染和潜伏神经系统的能力,VZV第7个开放阅读框(Open reading frame7,ORF7)嗜神经因子敲除的毒株有望成为更安全的VZV减毒活疫苗株,本文重组表达VZV ORF7蛋白,制备其单克隆抗体(Monoclonal antibody,McAb),建立ORF7荧光抗体检测方法,为新一代ORF7敲除的VZV减毒疫苗的检测提供方法学基础。本研究以V-Oka株orf7为扩增模板,构建重组表达质粒pET-28a-ORF7,转化至E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达后,镍离子柱亲合层析纯化表达蛋白,WB鉴定重组蛋白的活性,免疫BALB/c小鼠,应用杂交瘤技术制备抗VZV ORF7单克隆抗体,对单抗进行鉴定,选取一株稳定、特异、高效的单抗进行纯化并标记异硫氰酸荧光素(Fluorescein Isothiocyanate,FITC)。结果显示,重组ORF7蛋白以包涵体形式表达,分子量约29 kD,亲和纯化后纯度约为92.0%,盐酸胍复性蛋白可与VZV全病毒免疫小鼠血清特异性反应。采用杂交瘤细胞融合技术,筛选获得6株杂交瘤细胞,细胞上清单抗效价均达1∶51 200,6株单抗均属于IgG1亚类,抗原结合位点相同或相近,WB鉴定与VZV全病毒、原核及真核ORF7表达蛋白具有特异性反应。所制备FITC-4H7能够有效检出培养过程中ORF7蛋白,初步建立了病毒ORF7荧光抗体检测方法,为新型orf7基因敲除VZV减毒活疫苗毒株传代评价以及相关检测方法的建立奠定了基础。

    2022年03期 v.38 658-665页 [查看摘要][在线阅读][下载 1120K]
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  • 朊病毒感染对细胞中三羧酸循环关键催化酶的影响研究

    陈冬冬;高利萍;刘楚眸;刘欣;肖康;石琦;董小平;

    为了研究朊病毒感染对细胞氧化供能的主要途径—三羧酸循环关键催化酶的影响。使用ATP检测试剂盒检测朊病毒感染后细胞的ATP表达情况,采用蛋白免疫印迹方法检测朊病毒感染细胞中三羧酸循环关键催化酶的表达情况;使用细胞免疫荧光对催化酶进行细胞定位;应用线粒体分离试剂盒分离线粒体,检测线粒体中催化酶的表达情况。结果显示朊病毒感染后的细胞ATP表达水平明显降低,进一步检测三羧酸循环过程中三个主要的催化酶,发现这三个催化酶在朊病毒感染的细胞中表达量明显降低,免疫荧光实验显示催化酶与线粒体标志蛋白具有空间共定位现象,并发现在朊病毒感染细胞的线粒体中这三个催化酶的表达也显著降低。本研究发现朊病毒感染细胞中三羧酸循环催化酶的表达量明显降低,导致ATP产能下降,影响细胞代谢水平。

    2022年03期 v.38 666-674页 [查看摘要][在线阅读][下载 1622K]
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  • PAF对BV2细胞炎症因子分泌的影响及转录组学分析

    邹瑶;雷雨璇;周黎黎;尹益通;孙颖;刘慧;武伟华;王昕;房师松;郑青;

    探究血小板活化因子(Platelet activating factor,PAF)对BV2细胞炎症因子分泌的影响及初步推测其调控机制。外源PAF(2×10~(-5)M)作用于BV2细胞24 h,36 h,48 h后,(1)CCK8实验检测空白对照组,Mock组和PAF处理组细胞活性;(2)ELISA实验测炎症因子TNFα、IL-6、Cxcl2、IL-1a的分泌;(3)Western Blot检测炎症介质COX-2蛋白水平;(4)对PAF处理24h的BV2细胞以及对应的Mock组细胞进行RNA测序得到转录组测序结果;(5)GO和KEGG富集分析后,运用String数据库配合Cytoscape软件找出炎症相关的Hub基因并挑选出以下基因(Ccl4、Ccl3、Ccl7、IL-1a、Cxcl2、IL1f9、IL34、COX-2、Serpinb1a)进行qPCR验证。实验结果表明,PAF作用时间为24 h,36 h,48 h后,相比对照组:(1)BV2细胞活性降低;(2)上清液中的炎症因子TNFα,IL-6,IL-1a,Cxcl2分泌增加;(3)炎症介质COX-2蛋白表达水平上调;(4)从组学中筛选出炎症反应相关的Hub基因有:COX-2、Ccl3、Ccl4、Cxcl2、Ccl7、IL-1a、Mapk14、Cd80、Casp1、Src、Nos2、Serpinb1a、Serpinb9、Il1r1;(5)qPCR验证表达上调的基因包括Ccl3、Ccl4、Ccl7、IL-1a、Cxcl2、IL1f9、IL34、COX-2,表达下调的基因Serpinb1a。说明PAF可以诱导BV2细胞释放炎症因子,PAF可能是促进“细胞因子风暴”的重要介质,根据转录组学分析结果我们锁定了炎症反应密切相关的14种Hub基因,并对产生炎症因子的分子机制提出了初步推测。

    2022年03期 v.38 675-683页 [查看摘要][在线阅读][下载 1209K]
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  • 一株柯萨奇病毒B组5型分离株V1641/YN/CHN/2016的全基因序列分析

    许丹菡;郭伟;张名;冯昌增;丛山日;刘双芹;马绍辉;

    对2016年云南省昆明市手足口病相关的柯萨奇病毒B组5型分离株V1641/YN/CHN/2016(简称V1641)全基因组进行测序,并分析其分子变异和进化特点。设计针对V1641的引物,提取病毒RNA,RT-PCR扩增和测序,拼接获得的全基因组序列。利用MEGA7.0.26、Geneious9.1.4和SimPlot3.5.1软件分析全基因序列。V1641毒株基因组全长7 392nt,5'-UTR和3'-UTR分别长744nt和90nt,编码区长6 558nt,与其他CVB5相比未见核苷酸的插入和缺失,编码一个2 185aa的多聚蛋白。CVB5流行株大体上分为两个基因组,中国大陆流行株同原型株Faulkner一起分布于GenogroupⅠ分支,外国流行株大多分布于GenogroupⅡ分支。在GenBank中,V1641与KY303900-417/JS-CHN-2013最为同源,相似性为97.86%。V1641与其他中国大陆流行株的全基因组序列的核苷酸和氨基酸相似性分别为85.1%~97.8%和97.1%~99.6%。V1641在P1、P2和P3区段均与EV-B不同血清型的原型株聚类,经SimPlot3.5.1软件验证,提示有重组事件发生。云南CVB5分离株V1641同中国大陆流行株一样属于GenogroupⅠ基因群,在进化过程中可能发生了重组。中国大陆可能存在多条CVB5传播链。

    2022年03期 v.38 573-580页 [查看摘要][在线阅读][下载 2797K]
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动物病毒研究论著

  • 马立克病病毒pUL56蛋白对DF-1细胞免疫通路相关基因的转录调控研究

    张金城;马德青;徐贝贝;冯伟民;陈鑫;韦天超;韦平;黄腾;

    马立克病病毒(Marek's disease virus,MDV)UL56基因编码α-疱疹病毒同源蛋白pUL56。为全面了解该病毒蛋白与宿主细胞的互作关系,本研究首先将表达红色荧光蛋白标记的MDV pUL56质粒转染鸡DF-1细胞系,瞬时表达蛋白的细胞经流式细胞术分选,富集阳性细胞群进行高通量测序及mRNA转录组分析。测序结果显示,表达pUL56的DF-1细胞存在914个差异表达基因,其中462个上调,452个下调。通过GO、KEGG和Reactome通路富集分析,发现富集的显著差异表达基因分布于先天性免疫反应、细胞因子产生等相关信号通路。在此基础上,随机选取了I型干扰素信号通路和促炎症细胞因子基因进行RT-qPCR验证,IFI6、IFIH1、CD83、HSP90AA1、IL-1β和IL-8L1基因的表达量均为上调,而IL-12β表达则下调,该结果与高通量测序相符。本研究提示pUL56作为非结构蛋白,可能对宿主细胞过程有广泛的调节作用。

    2022年03期 v.38 684-693页 [查看摘要][在线阅读][下载 1319K]
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昆虫病毒研究论著

  • 一株雀纹天蛾核型多角体病毒的鉴定及其基因组序列分析

    占智高;关丽梅;况文东;王金昌;陈俊晖;周溪;范兆军;邓菲;王君;靳亮;

    从自然死亡的雀纹天蛾幼虫分离到一株雀纹天蛾核型多角体病毒。通过扫描及切片透射电镜发现,该病毒为单粒包埋型核型多角体病毒,命名为ThjaSNPV(Theretra japonica single nucleopolyhedrovirus)。病毒全基因组重测序后拼接显示,该病毒基因组全长134 899 bp,GC含量37.28%,与豆天蛾单粒包埋型核型多角体病毒株DZ1基因组序列相似性高达96.24%。ThjaSNPV含有131个开放阅读框(ORF)其中55个为正链基因,76个为负链基因,与宿主同为天蛾科的豆天蛾单粒包埋型核型多角体基因组相比,雀纹天蛾单粒包埋型核型多角体病毒新注释到7个基因:chitin-binding protein(ORF9),ODV-E18(ORF11),lef-11(ORF27),hypothetical protein(ORF41),lef-10(ORF42),pif-6(ORF66),P6.9(ORF88)。ThjaSNPV的DNA光裂酶基因(DNA photolyase,ORF53)中不具有豆天蛾NPV中的1bp碱基的缺失,只编码一个大的完整DNA裂合酶。38个串联的核心基因的进化分析显示雀纹天蛾NPV与Alphabaculovirus group II类群聚类在一起,且和豆天蛾NPV最为相似。

    2022年03期 v.38 694-704页 [查看摘要][在线阅读][下载 2114K]
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植物病毒研究论著

  • 桑花叶萎缩类病毒基因组核酶活性及其对桑树侵染性的研究

    杨金宏;江微;凌君;孔卫青;

    桑花叶萎缩类病毒(Mulberry mosaic dwarf viroid,MMDVd)基因组由单链环状小分子RNA组成,根据预测二级结构可能存在锤头核酶(Hammerhead ribozyme,HH)和疑似发夹核酶(Hairpin ribozyme,HP),但目前还缺乏对核酶活性的研究。本研究使用体外自切割和2,3-环磷酸基测序对核酶活性及自切割位点进行了鉴定,并在发夹核酶Loop1增加一对碱基设计合成了突变核酶MMDVd-HP',比较了其与MMDVd-HP的活性差异,分析了MMDVd对正常未染病和桑花叶卷叶病相关病毒(Mulberry mosaic leaf roll-associated virus,MMLRaV)阳性桑树的侵染。体外自切割结果显示,所有核酶均成功自切割产生了相应的单体,均有核酶活性。2,3-环磷酸基测序结果显示,腺苷化接头分别连接于第7位的C和302位的A之后,MMDVd-HH的切割位点位于AUC↑处,MMDVd-HP切割位点位于ACA↓处。定量PCR结果显示反应体系中的MMDVd-HP多于MMDVd-HP',表明MMDVd-HP'更多的发生了切割,活性高于MMDVd-HP。侵染性实验结果显示,桑树(-)没有检测到MMDVd,而所有桑树(MMLRaV)样本均检测到了MMDVd,说明MMDVd能侵染桑树(MMLRaV),与satRNA的特征相似。

    2022年03期 v.38 705-713页 [查看摘要][在线阅读][下载 1170K]
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综述

  • 新型冠状病毒入侵的宿主因子及潜在抗病毒药物研究进展

    林聪湄;张浩;卢鑫可;齐璐璐;申屠旭萍;冯华朋;邬丽;

    新型冠状病毒(SARS-CoV-2)是一种新发高传染性的冠状病毒。因其编码有限的病毒蛋白,SARS-CoV-2需要借助多种宿主因子完成其生命周期,而大多数参与其中的宿主因子及作用机理仍不明确。因此,研究参与SARS-CoV-2复制周期的宿主因子及作用机理,将有助于我们对病毒生命周期的认识及寻找抗SARS-CoV-2药物的作用靶点,从而可以帮助人们更加有效地防控新冠疫情。本文归纳了参与SARS-CoV-2复制周期中入侵的宿主因子,对全面理解SARS-CoV-2致病的分子机制、病毒感染的快速诊断及抗病毒新药研发具有重要的意义。

    2022年03期 v.38 714-723页 [查看摘要][在线阅读][下载 1098K]
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  • 人呼吸道合胞病毒感染对机体相关免疫应答影响的研究进展

    郑海涛;丁樱;任献青;袁斌;马淑霞;李向峰;孙晓旭;邱建利;韩姗姗;闫永彬;

    人呼吸道合胞病毒(HRSV,Human respiratory syncytial virus)是全球婴幼儿罹患严重下呼吸道疾病感染的主要原因,也是老年人和免疫缺陷者发病、住院和死亡的重要因素,严重威胁婴幼儿、老年人和免疫缺陷者的健康。深入了解HRSV的的生物学特性、致病机理及其对相关免疫应答的影响,对研发安全有效的抗HRSV疫苗、建立积极的预防措施,以减少疾病发生率和重症病例死亡率,具有十分重要的促进作用。

    2022年03期 v.38 724-730页 [查看摘要][在线阅读][下载 1002K]
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  • 牛传染性鼻气管炎检测方法的最新研究进展

    何云江;张玲艳;贾伟娟;郗珊珊;王学理;

    牛传染性鼻气管炎(Infectious bovine rhinotracheitis,IBR)是一种由牛传染性鼻气管炎病毒(Infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV)引起的以病牛呼吸道病变为主要特征的传染性疾病,由于其严重的病理损害以及广泛的传播性,给养牛业造成巨大经济损失,因此建立快速、准确的检测方法对该病的防控尤为重要。本文主要对IBR的最新检测方法进行了简述和总结,以期为科学检测、鉴定IBR提供依据和思路。

    2022年03期 v.38 731-737页 [查看摘要][在线阅读][下载 986K]
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  • 猪δ冠状病毒主要蛋白功能研究进展

    黄瑶;曹飞;李凤琴;谷思睿;王玉玲;岳健国;徐志文;周远成;朱玲;

    猪δ冠状病毒(Porcine Deltacoronavirus,PDCoV)是冠状病毒科,δ冠状病毒属成员,为单股正链RNA病毒。由于猪δ冠状病毒是一种新型肠道冠状病毒(于2012年首次报道),目前对其研究较少,缺少商品化的疫苗。对疫病的防控无疫苗可用,一旦发病,会对猪场造成严重损失。本文综述了已有的关于猪δ冠状病毒结构蛋白、辅助蛋白、非结构蛋白等的特点和功能,以期为深入研究PDCoV致病机制和免疫机理提供参考,从而有助于其疫苗研发。

    2022年03期 v.38 738-745页 [查看摘要][在线阅读][下载 1037K]
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  • 大口黑鲈蛙虹彩病毒病研究进展

    董寒旭;曾伟伟;

    大口黑鲈(Micropterus salmoides),俗称加州鲈,是我国最重要名优养殖鱼类之一,具有极高的产业开发价值。近年来,大口黑鲈的养殖产业获得了飞速发展,而病害问题成为制约大口黑鲈产业持续健康发展的主要因素,其中以蛙虹彩病毒感染引起的病毒性疾病影响最大。本文就大口黑鲈蛙虹彩病毒病的研究历史、临床症状和病理变化、流行病学、感染机制、疾病诊断及防控措施等方面的研究进展进行综述,以期为该病的基础研究和疫病防控提供参考。

    2022年03期 v.38 746-756页 [查看摘要][在线阅读][下载 1063K]
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  • 昆虫病毒资源的开发及其应用进展

    黄昱栋;孙凯;路惠馨;俞晓平;

    昆虫数量占地球上现存动物数量的65%,感染昆虫的病毒种类更是纷繁多样。与其他微生物相比,病毒具有基因组小、遗传操作简单等特点,是一类蕴藏巨大应用潜能的生物资源。在过去的十年里,随着新一代测序技术和生物信息学科的迅猛发展,科学界进入了一个快速鉴定昆虫新病毒的新时代。昆虫病毒多样性研究为揭示昆虫和病毒的协同进化机制提供新见解,同时为昆虫病毒的商业化应用带来新思路。本文根据昆虫病毒近期的研究进展,概述高通量测序技术鉴定昆虫病毒的原理和方法,并对昆虫病毒的资源属性及应用前景进行探讨,为有害昆虫的防治及虫媒病害的防控提供理论基础。

    2022年03期 v.38 757-768页 [查看摘要][在线阅读][下载 1090K]
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信息

  • 《中文核心期刊要目总览》入编通知

    <正>《病毒学报》主编先生/女士:我们谨此郑重通知:依据文献计量学的原理和方法,经研究人员对相关文献的检索、统计和分析,以及学科专家评审,贵刊《病毒学报》入编《中文核心期刊要目总览》2020年版(即第9版)基础医学类的核心期刊。该书由北京大学出版社出版。书中按《中国图书馆分类法》的学科体系,列出了74个学科的核心期刊表,并逐一对核心期刊进行了著录。著录项目包括:刊名、并列刊名、主办单位、出版年、出版频率、中图分类号、ISSN号、CN号、邮发代号、编辑部地址、电话、网址、内容简介等。

    2022年03期 v.38 499页 [查看摘要][在线阅读][下载 1258K]
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  • 中国学术期刊影响因子年报(自然科学与工程技术·2021版)

    <正>~~

    2022年03期 v.38 504页 [查看摘要][在线阅读][下载 348K]
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  • 2022年中国微生物学会及各专业委员会学术活动计划表

    <正>~~

    2022年03期 v.38 505-506页 [查看摘要][在线阅读][下载 190K]
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  • 《病毒学报》征稿简则

    <正>(2018年12月25日修订)《病毒学报》是病毒学专业学术刊物,创刊于1985年,国际标准连续出版物号:ISSN 1000-8721,国内统一连续出版物号:CN 11-1865/R,国内邮发代号:82-227,国外发行代号:BM 6448。主管单位是中国科学技术协会,主办单位是中国微生物学会,承办单位是中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所,出版单位是《病毒学报》编辑部。《病毒学报》是中国精品科技期刊、中国科技核心期刊、北京大学基础医学核心期刊《中文核心期刊要目总览》、武汉大学RCCSE(中国科学评价研究中心)中国核心学术期刊。

    2022年03期 v.38 507页 [查看摘要][在线阅读][下载 298K]
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