- 伍志坚,吴小兵,侯云德
为了便于开展用重组腺病毒伴随病毒 (recombinantadeno associatedvirus,rAAV)载体进行基因治疗的研究 ,构建了三种通用型AAV载体 pWAV 1、pWAV 2和 pSNAV ,每种载体均含有AAV 2两端的倒转末端重复序列 (in vertedterminalrepeats,ITR) ,中间依次为巨细胞病毒 (CMV)立早增强子和启动子、多克隆位点和 polyA信号。研究者只需将目的基因正向插入多克隆位点 ,即可获得具有完整表达盒的AAV载体质粒。pWAV 1的多克隆位点包括NheⅠ、XhoⅠ、PstⅠ和BamHⅠ ,可插入外源基因的最大容量为 3 3kb ;pWAV 2的多克隆位点为 Kpn Ⅰ、EcoRⅠ、SalⅠ ;pSNAV的多克隆位点为Kpn Ⅰ、EcoRⅠ、SalⅠ和 BglⅡ ,二者所能装载的外源基因容量均为3 6kb。同时 ,还构建了携带 β 半乳糖苷酶基因的AAV载体 pAV lacZ、pSNAV lacZ ,并对制备rAAV的常规方法———共转染法进行了改进。用先前报道的具有rAAV包装功能的一种重组单纯疱疹病毒 (recombinantherpessim plexvirus,rHSV)分别感染经pAV lacZ、pSNAV lacZ转染的BHK 2 1细胞 ,可获得携带 β 半乳糖苷酶基因的rAAV ,滴度达到 5× 10 4 转导单位 (TU) /ml,为实现“一种病毒感染一个载体细胞株”的rAAV生产策略提供了可能
2000年01期 1-6页 [查看摘要][在线阅读][下载 92k] [下载次数：204 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：38 ] |[阅读次数：0 ] - 谭明岐,纪志武,张帆,李殿俊,阮力
将含脊髓灰质炎病毒 (PV)RNA聚合酶的不同长度基因片段克隆到载体 pSG5质粒上 ,分别构建了 4个表达RNA聚合酶的质粒。体外转录实验证明 ,pSG5 POL1 99和 pSG5 POL2 0 3质粒转染细胞的提取物促进了特异的RNA转录 ,表明两质粒可表达RNA聚合酶。将PV的 5'NCR序列插在载体 pGREENLANTERN 1的CMV启动子下游 ,构建了 pGREENLANTERN 1 5'NCR质粒 ;用 LacZ基因替换GFP基因分别插入到PGREENLANTERN 1和pGREENLANTERN 1 5'NCR质粒上 ,构建成 pLacZLANTERN 1和 pLacZLANTERN 1 5'NCR质粒。表达RNA聚合酶的质粒与 pLacZ 5'NCR调控表达报告基因的质粒共转染 ,明显提高了报告基因的表达水平 ,表明PV的表达调控元件和RNA聚合酶基因可用于构建外源基因高效表达载体。
2000年01期 7-11页 [查看摘要][在线阅读][下载 63k] [下载次数：49 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 王志玉
为了确定副粘病毒融合蛋白 (F)分子上活性位点中亮氨酸在F的细胞融合作用中的作用 ,弄清F融合细胞的分子机理 ,采用基因定点突变法创造一个酶切位点 ,用酶切反应初步筛选突变株 ,然后用DNA序列分析进一步确定 ,并在真核细胞内进行表达 ,Giemsa染色和指示基因法检测细胞融合功能 ,荧光强度分析 (FACS)检测表达效率。结果表明 ,hPIV3F第 46 0位亮氨酸 (L)和第 474位异亮氨酸 (I)分别突变成丙氨酸 (A) (L46 0A和I474A)时 ,细胞融合功能分别只相当于野毒株的 5 1 2 4%和 48 73% ;而第 46 7位L和第 481位L分别突变成A(L46 7A和L481A)时 ,细胞融合功能则无明显改变 ;当第 46 0和 46 7位L同时突变成A(L46 0A～L46 7A)时 ,细胞融合功能降低了79 13% ;而第 474位I和第 481位L同时突变成A(I474A～L481A)时 ,细胞融合功能无明显改变。NDVF第 481位L和第 488位L分别突变成A(L481A和L488A)时 ,细胞融合功能分别降低了 75 2 2 %和 80 0 4% ;将二者共同突变时 ,则进一步降低 ,只有野毒株的 10 13%。各突变株的表达效率没有改变。说明F分子上与HN相互作用的特异性区域中的亮氨酸在细胞融合中发挥着重要作用 ,即hPIV3F第 46 0位L和第 474位I,NDV第 481和 488位L ,突变后细胞融合作用不同程度下降。
2000年01期 12-16页 [查看摘要][在线阅读][下载 107k] [下载次数：132 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：16 ] |[阅读次数：0 ] - 朱明华,段凌浔
应用抗HIV 1Rev单链抗体细胞内免疫方法 ,研究在人T细胞和周围血淋巴单核细胞内抗病毒复制的效果 ,探讨细胞内免疫抗HIV 1基因治疗的可行性。克隆抗HIV 1Rev单链抗体 (sFv)基因 ,以逆转录病毒为基因载体 ,将包装后的含靶基因的逆转录病毒转导至人CD4 阳性T 细胞株CEM和SupT1,以及HIV 1阴性自愿者的周围血淋巴单核细胞 (PBMC) ,再分别用不同剂量 (MOI)的HIV 1病毒株PNL4 3 和HxB2 进行病毒攻击实验。测定HIV 1p2 4抗原。滴度以了解抗病毒复制的效果 ,检测带报道基因CAT以了解靶基因在细胞内的表达状况。分别应用0 2 4、0 0 6和 0 0 2 4MOI的PNL4 3 或HxB2 病毒株攻击 ,测定p2 4抗原。结果显示 ,抗RevsFv细胞内表达能有效地抑制病毒在细胞内的复制 ,与对照组比较 ,病毒复制被抑制效率达 90 %以上。体外培养细胞 2个月 ,仍可观察到效果 ,病毒攻击后合胞体细胞形成显著减少。CAT实验表明 ,逆转录病毒载体可使靶基因在人T细胞和PBMC内有效表达。抗HIV 1RevsFv细胞内表达可有效地抑制病毒复制 ,有望成为抗HIV 1基因治疗的一种手段
2000年01期 17-23页 [查看摘要][在线阅读][下载 138k] [下载次数：57 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：0 ] - 刘力,王树蕙
在腺病毒交替的 poly(A)位点使用过程中 ,靠近主要晚期启动子的L1poly(A)位点起着主导的作用。前期的实验已经发现 ,在L1poly(A)位点的上游存在一个RNA的抑制元件叫URE ,缺失URE可以使模拟小基因的 poly(A)进入病毒晚期的感染方式。现将L1poly(A)位点单独游离出来 ,用体外的紫外交联的方法对其进行研究 ,结果发现在没有紫外光照射的情况下 ,仍有一组小于 30kD的独特的RNA酶A抗性共价复合物形成。这个复合物的产生完全依赖于核提取液中的蛋白因子 ,并且与URE中的特定RNA序列直接相关。这种独特的在没有紫外光照射情况下形成的RNA 蛋白质共价复合物说明 ,URE效应或许是通过与特异的核内蛋白因子反应而达到的。这一结果为进一步克隆这些蛋白因子提供了前提保证。
2000年01期 24-28页 [查看摘要][在线阅读][下载 107k] [下载次数：60 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：0 ] - 夏宁邵,杨海杰,张军,林长青,王颖彬,王隽,詹美云,吴文翰
利用原核表达载体 pRSET或 (和 )pGEX在大肠杆菌内表达了覆盖庚型肝炎病毒 (HGV)C NS3和NS5区的多段基因。CE1、E2、NS3、NS5及NS3 NS5嵌合基因等的 8段基因均有高效表达 ,各重组蛋白产量与菌体总蛋白之比在 10 %～ 35 %之间。对以上重组蛋白进行免疫学筛选 ,证实其中 7个重组蛋白均具免疫学活性 ,在一定程度上确定了重组HGV抗原表位的分布 ,为HGV的血清学和免疫学诊断试剂的研究奠定了坚实基础
2000年01期 29-33页 [查看摘要][在线阅读][下载 77k] [下载次数：84 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：0 ] - 马洪超,苏艳,孙淑芳,尹燕博,蒋正军
用RT PCR扩增我国蓝舌病毒Z1株的 VP7基因 ,直接将其克隆至 pGEM T载体中 ,用限制性内切酶EcoRⅠ分析经蓝 /白斑筛选和PCR鉴定的重组质粒 ,用DIG标记克隆片段制成探针与病毒基因组进行Northernblot杂交 ,证明插入片段为BTVVP 7基因特异性片段。采用Sanger双脱氧终止法测定cDNA片段的核苷酸序列 ,将这一序列与国外已发表的 9株蓝舌病毒及相关的环状病毒的VP 7基因进行了比较分析 ,结果表明 :国内BTVZ1株的VP 7基因的核苷酸序列与上述 9个毒株的同源性在 71 4%～ 98 7%之间 ,与USABTV 10株的同源性最高 ,与AUSBTV 15株的同源性最低。该研究对于我国蓝舌病基因工程疫苗的研制及对该病分子流行病学的调查有着重要意义。
2000年01期 34-37页 [查看摘要][在线阅读][下载 55k] [下载次数：87 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：3 ] |[阅读次数：0 ] - 潘兹书,张楚瑜,丁建华,罗满林,雷亮
对伪狂犬病毒湖北株 (PRVHB株 )蛋白激酶 (PK)基因进行了克隆和序列测定。分析比较了该序列与PRVNIA 3株、Ka株以及HSV 1、VZVPK基因的同源性。结果显示 ,在测定全长 1312bp的DNA序列中 ,包括着一个10 0 2核苷酸的开放读框 ,可编码 334个氨基酸组成的多肽。PRV HB株PK与PRV NIA3、PRV Ka、HSV 1、VZVPK基因比较 ,核苷酸的同源性分别为 98 7%、97 5 %、5 0 7%和 42 0 % ;基因编码区氨基酸序列的同源性分别为98 2 %、95 8%、37 7%和 37 2 %。PRVPK具有细胞丝氨酸 /苏氨酸蛋白激酶催化结构域的保守氨基酸共有序列和亚结构域特征序列。
2000年01期 38-43页 [查看摘要][在线阅读][下载 119k] [下载次数：176 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：14 ] |[阅读次数：0 ] - 曲志才,吕英芝,沈大棱,苏德明,Hull R
利用RT -PCR技术 ,合成并扩增了水稻条叶枯病毒 (RStV)中国云南分离物基因组组分 3的全长cDNA。将PCR产物克隆在载体 pCRⅡ上 ,进行全序列测定。将所得核苷酸序列及其所推导的氨基酸序列与日本分离物T进行同源性比较 ,结果表明 ,在核苷酸水平上 ,两分离物的 5′端非编码区序列相同 ,vORF、vcORF及基因间非编码区序列的同源性分别为 97 6 %、96 8%及 87 6 % ,而 3′端非编码区同源性为 98 9% ,仅有一个核苷酸不同 ;在氨基酸水平上 ,vORF及vcORF编码蛋白的同源性分别为 99 1%和 98 5 %。可见编码区的大小及其氨基酸序列和两末端序列都是很保守的。序列分析显示 ,两个RStV分离物的RNA3均有双义编码特性。因此 ,中国云南分离物Y与日本分离物T可能有很近的亲缘关系。
2000年01期 44-48页 [查看摘要][在线阅读][下载 104k] [下载次数：68 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：0 ] - 韩成贵,李大伟,于嘉林,秦树才,杨莉莉,刘仪
以甜菜坏死黄脉病毒内蒙分离物 (BNYVVNM )总RNA为模板 ,经RT -PCR扩增 ,分别获得RNA2、RNA3和RNA4自然缺失突变体的cDNA克隆。序列分析结果表明 ,RNA2自然缺失突变体在 75kD通读蛋白编码区C端缺失 34 8个核苷酸 (缺失位置nt1488～nt1835 )。RNA3在其 2 5kD蛋白编码区内缺失 36 0个核苷酸 (缺失位置nt72 9～nt10 88)。RNA4的自然缺失区域位于 31kD蛋白编码区 ,缺失 40 2个核苷酸 (nt70 2～nt110 3) ,缺失未造成移码 ,仍可编码产生一个由 148个氨基酸组成的蛋白。BNYVV内蒙分离物上述 3个RNA组分的自然缺失突变体的缺失区域 ,与国外报道的德国G1分离物和日本S分离物的自然缺失区域非常相似。同时 ,对自然缺失的可能机制及其在病害防治上的应用进行了讨论。
2000年01期 49-53页 [查看摘要][在线阅读][下载 59k] [下载次数：80 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：9 ] |[阅读次数：0 ] - 季平,何家禄,吕鸿声,吴祥甫
以苜宿银纹夜蛾核型多角体病毒 (AcMNPV)的egt基因作探针 ,从家蚕核型多角体病毒镇江株 (BmNPVZJ- 8)基因组中克隆了egt基因及其旁侧序列 ,作了该片段的酶切图谱 ;测定了BmNPVZJ - 8egt基因序列。与AcMNPV的egt基因相比同源性为 95 % ;基因大小都为 15 18bp。利用egt基因旁侧序列构建了转移载体pUDegt,以绿色荧光蛋白基因 (EGFP)作报告基因取代egt基因 ,构建了由EGFP取代egt基因的重组病毒BmDegt。将含egt基因的BmNPV和不含egt基因的重组病毒BmDegt分别注射感染四龄家蚕幼虫 ,发现BmDegt感染的家蚕个体生长速度缓慢 ,家蚕个体小 ,死亡时间提前
2000年01期 54-58页 [查看摘要][在线阅读][下载 96k] [下载次数：150 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：21 ] |[阅读次数：0 ] - 周国林,梁国栋,付士红,何海怀,金奇,张海林,黄文丽,侯云德2000年01期 59-60页 [查看摘要][在线阅读][下载 20k] [下载次数：66 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：0 ]
- 王战会,孙剑,侯金林,陈金军,肖蕾,骆抗先2000年01期 61-64页 [查看摘要][在线阅读][下载 38k] [下载次数：43 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：0 ]
- 王家富,张楚瑜,丁建华,周荣,温淑娟,黄镇华2000年01期 65-69页 [查看摘要][在线阅读][下载 96k] [下载次数：79 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：10 ] |[阅读次数：0 ]
- 姜平,陈溥言,姜志华,蔡家利,董永毅,蔡宝祥2000年01期 70-72页 [查看摘要][在线阅读][下载 51k] [下载次数：189 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：31 ] |[阅读次数：0 ]
- 徐洪涛,朴春爱,杨朵,王雷,张新宇,侯云德2000年01期 73-75页 [查看摘要][在线阅读][下载 35k] [下载次数：166 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：30 ] |[阅读次数：0 ]
- 徐洪涛,屈建国,朴春爱,王文兴,王运涛,相建海,洪涛2000年01期 76-79页 [查看摘要][在线阅读][下载 108k] [下载次数：90 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：0 ]
- 叶荣,郑滔,徐磊,雷娟利,陈剑平,于善谦2000年01期 80-82页 [查看摘要][在线阅读][下载 47k] [下载次数：221 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：29 ] |[阅读次数：0 ]
- 杜志强,周广和,马占鸿,李莉,王锡锋,常胜军2000年01期 83-85页 [查看摘要][在线阅读][下载 47k] [下载次数：123 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：4 ] |[阅读次数：0 ]
- 郭斐,许洪林,阮力2000年01期 86-89页 [查看摘要][在线阅读][下载 63k] [下载次数：173 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：8 ] |[阅读次数：0 ]
- 唐槐静,段胜仲,洪嘉玲,姚学军2000年01期 90-93页 [查看摘要][在线阅读][下载 53k] [下载次数：153 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：4 ] |[阅读次数：0 ]
- 2000年01期 94-96页 [查看摘要][在线阅读][下载 34k] [下载次数：75 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ]
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