- 姚艳丰;蓝佳明;李枫棣;牛培华;于品;卢帅;鲍琳琳;谭文杰;秦川;
本研究探讨不同剂量DPP4转导小鼠后对中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus,MERS-CoV)感染建模及其生物特性的影响。首先将表达MERS-CoV受体DPP4的重组腺病毒以高剂量(2.5×108 PFU/只)、低剂量(0.5×108 PFU/只)分别转导转导BALB/c小鼠,继而滴鼻接种MERS-CoV,建立MERS-CoV感染小鼠模型。对成功构建的小鼠感染模型分别进行体征、病毒复制、免疫病理及抗体应答的比较分析。结果表明:两种剂量DPP4转导后MERS-CoV感染小鼠,均可引起典型肺炎表征,在小鼠肺部能检测到病毒复制及免疫病理,但高剂量DPP4转导组小鼠肺炎体征与肺病理损伤更明显,病毒复制水平亦高于低剂量DPP4转导组。小鼠感染建模后2w后可检测到结构蛋白特异抗体与中和抗体,高剂量DPP4转导组抗体应答亦明显高于低剂量转导组。本研究以两种剂量DPP4转导小鼠,均成功建立了MERS-CoV感染的小鼠模型,受体DPP4转导水平可影响MERS-CoV感染小鼠体征、病毒复制及抗体应答。
2015年06期 v.31 593-600页 [查看摘要][在线阅读][下载 448K]
[下载次数：278 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：9 ] |[阅读次数：3 ] - 梁艳;李晨;Mariska G M van Rosmalen;Gijs J L Wuite;Wouter H Roos;
原子力显微镜(Atomic force microscopy,AFM)作为一种纳米级高分辨率的探针扫描显微镜,在病毒形态学研究等领域有广泛的应用。为更好地利用AFM在接近病毒生理环境(液相)中观测单个病毒颗粒,选择合适的基底吸附病毒样品是重要的前提保障。本文介绍了一种病毒样品制备及AFM液相成像方法。首先制备疏水化处理的玻璃盖玻片作为吸附基底,再将观察样品腺病毒重组载体颗粒(Adenovirus type 5F35,Ad5F35)吸附于基底上,建立在液相下单个病毒颗粒的原子力显微镜成像方法。通过该方法获取了单个腺病毒颗粒在液相下的高分辨率纳米级高度图(height image),且病毒颗粒保持了约90nm的正确测量高度。实验结果表明疏水化处理的玻璃基底具有良好的吸附力,有助于病毒颗粒牢固地吸附在基底上,且不会引起较大的形变。本研究为AFM观测病毒等生物样品提供了一种较为合适的吸附基底和在液相中的AFM成像方法,对后期开展病毒形态结构、物理属性及其与宿主细胞受体相互作用的研究打下基础。
2015年06期 v.31 601-606页 [查看摘要][在线阅读][下载 366K]
[下载次数：337 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：3 ] - 袁静;鲍琳琳;魏强;秦川;许黎黎;
基于液相芯片(Multi-analyte suspension array,MASA)技术建立一种同时对H5N1和H7N9亚型流感病毒进行快速检测的新方法。对国家生物技术信息中心(National center for biotechnology information,NCBI)和欧洲生物信息学中心(The european bioinformatics institute,EBI)核酸数据库中已有的H5、N1、H7和N9核酸片段进行比对分析,并参考世界卫生组织,美国疾病预防控制中心和中国疾病预防控制中心等的相关资料,设计简并引物和探针,将合成的探针与荧光编码微球进行偶联,建立检测方法。利用该方法检测H5N1和H7N9亚型流感病毒和其它常见亚型(H1N1、甲流H1N1、H5N2、BH3N2和H9N2)的标本。建立了一种快速的流感病毒分型方法。这种方法可以同时检测H5N1和H7N9,用已知基因型的样本对这种方法进行验证显示它的特异性很好。灵敏度分析实验也表明这种方法具有很高的灵敏度,可以对含有5个拷贝的样本进行有效的检测。利用液相芯片技术研制的H5N1和H7N9亚型流感病毒检测方法能够用于流感病毒H5N1和H7N9亚型的快速、灵敏、特异性的检测及鉴定。
2015年06期 v.31 607-614页 [查看摘要][在线阅读][下载 269K]
[下载次数：302 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：9 ] |[阅读次数：3 ] - 张烨;李晓丹;邹淑梅;薄洪;董丽波;高荣保;王大燕;舒跃龙;
为了解中国活禽市场环境样本中禽流感病毒分布情况,对全国2009~2013年采自活禽市场的环境样本进行流感病毒核酸检测,并利用无特殊致病原鸡胚(SPF鸡胚)对A型流感病毒核酸阳性标本进行病毒分离。结果显示,环境标本中禽流感病毒核酸阳性率的波动呈明显的季节性趋势,冬春季节核酸检测阳性率较高;我国南方地区活禽市场环境样本的禽流感病毒核酸阳性率高于北方。市场中清洗禽类的污水和宰杀或摆放禽肉案板表面的擦拭样本核酸阳性率高于其它类型的样本。2009~2013年环境样本中分离到的禽流感病毒以H5和H9亚型为主,2013年之前H5亚型多于H9亚型,而2013年H9亚型超过了H5亚型。本研究表明,对城乡活禽市场中禽流感病毒的实时监测具有重要的公共卫生意义,可为我国人感染禽流感病毒的防控和预测预警提供依据。
2015年06期 v.31 615-619页 [查看摘要][在线阅读][下载 141K]
[下载次数：718 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：73 ] |[阅读次数：2 ] - 梁超琼;孟嫣;罗来鑫;刘鹏飞;李健强;
本研究对江苏、浙江、湖南和北京等四个地区的葫芦、西瓜、黄瓜、西葫芦和甜瓜上的黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)129kD和57kD蛋白复制酶基因分别进行扩增、测序和序列分析。结果显示,供试CGMMV分离物CGMMV-No.1、CGMMV-No.2、CGMMV-No.3、CGMMV-No.4和CGMMVNo.5的129kD和57kD蛋白复制酶基因序列相似性分别为99.64%和99.74%,其中CGMMV-No.1、CGMMVNo.3和CGMMV-No.4的相似性较高,三者的129kD和57kD蛋白复制酶基因序列相似性分别为99.95%和99.94%,而CGMMV-No.2的129kD和57kD蛋白复制酶基因序列与其余四个参比序列的相似性相对较低,分别为99.16%~99.27%和99.04%~99.18%;供试样品在基于129kD和57kD蛋白复制酶基因序列构建的NJ系统发育树中均被分为6个类群,CGMMV-No.1、CGMMV-No.3、CGMMV-No.4与GenBank上已报道的中国山东分离物(Accession No.KJ754195)聚为一支,CGMMV-No.5与中国辽宁分离物(Accession No.EF611826)聚为一支,而浙江的CGMMV-No.2西瓜分离物在129kD蛋白复制酶基因系统发育树中与韩国西瓜分离物(Accession No.AF417242)聚为一支,其在57kD蛋白复制酶基因系统发育树中独立成群。本研究中供试CGMMV分离物的129kD和57kD蛋白均无显著疏水性,也无高度卷曲螺旋部位,ProtParam预测显示仅CGMMV-No.4的129kD蛋白为稳定蛋白,其余均为不稳定蛋白,CGMMV-No.1、CGMMV-No.2、CGMMV-No.3和CGMMV-No.5的129kD蛋白分别有6个、6个、2个和4个可能的跨膜结构区域,CGMMV-No.2、CGMMV-No.4和CGMMV-No.5的57kD蛋白分别有13个、13个和5个可能的跨膜结构域,供试样品129kD蛋白的糖基化位点分别有2个、4个、4个、4个和4个,57kD蛋白的糖基化位点分别有2个、5个、2个、5个和2个,其129kD和57kD蛋白的紊乱区、球蛋白区、磷酸化位点以及B细胞抗原表位位点均存在差异。综合分析认为,供试CGMMV分离物复制酶基因序列相似性较高,种内稳定且保守,种间差异明显;CGMMVNo.1、CGMMV-No.3、CGMMV-No.4和CGMMV-No.5与中国山东、辽宁分离物的亲缘关系较近,可能具有相同的侵染来源,而CGMMV-No.2与韩国分离物的亲缘关系较近,序列相似性高的供试样品在系统发育树中聚为一类;供试CGMMV分离物129kD和57kD蛋白生物信息学分析结果不具规律性。
2015年06期 v.31 620-628页 [查看摘要][在线阅读][下载 301K]
[下载次数：329 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：5 ] |[阅读次数：2 ] - 张瑾;薛晓宁;徐翮飞;朱可;陈晓光;张娟;张齐;林元;
为了获得内含甲/乙型流感病毒部分序列的病毒样颗粒,本研究通过定点突变技术将6个组氨酸插入MS2噬菌体包膜蛋白的β-发夹环结构中,建立通用表达载体D-pET32a-CP-his。并采用聚合酶链反应扩增甲/乙流病毒cDNA的部分保守区域,将两种病毒的嵌合体基因序列连接到表达载体,转化BL21细胞。经诱导表达和镍柱亲和层析纯化,获得了含有甲/乙型流感病毒部分序列的高浓度和纯度的病毒样颗粒。该病毒样颗粒在4℃和-20℃条件下可稳定保存。本研究构建带有组氨酸纯化标签假病毒的通用表达载体,可以作为以后构建和制备耐RNase的mRNA标准品和质控品的平台;构建的甲/乙型流感嵌合体假病毒可为实验室流感病毒的检测提供新的标准品及质控品。
2015年06期 v.31 629-633页 [查看摘要][在线阅读][下载 230K]
[下载次数：311 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：2 ] - 王玉莹;陈奇;刘晔;扈荣良;张乐萃;
本研究利用复制缺陷型人5型腺病毒载体,表达了我国蝙蝠狂犬病毒分离株IRKV-THChina12的G基因,并将重组病毒命名为rAd5-IRKV-G。Western blot和间接免疫荧光试验证明,IRKV-THChina12的G基因在重组腺病毒感染的293AD细胞中得到表达。将rAd5-IRKV-G对小鼠分别进行腹腔和肌肉免疫,同时设立wt-rAd5对照,结果显示两种免疫方式均能诱导小鼠产生抗IRKV中和抗体,且rAd5-IRKV-G组与wt-rAd5组差异显著(P≤0.05),腹腔免疫组与肌肉免疫组无显著差异(P>0.05)。结果表明,Irkut病毒糖蛋白可以作为疫苗抗原,而且构建的重组腺病毒具有较好的免疫原性。
2015年06期 v.31 634-640页 [查看摘要][在线阅读][下载 329K]
[下载次数：189 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：2 ] - 尉研;李江姣;王焕琴;岑山;梁国栋;谭文杰;朱武洋;
建立抗甲病毒化合物高通量筛选模型可为筛选和分析抗甲病毒药靶提供技术基础。本研究以含有分泌型荧光素酶(Gaussialuciferase,GLUC)报告基因标记的重组辛德毕斯病毒XJ160-GLUC为分子基础,建立了抗甲病毒化合物的高通量筛选模型,并对感染复数、检测时间等参数进行优化。经过优化,筛选模型的Z’因子值可达到0.71,表明我们所建立的筛选模型具有较好的稳定性。应用该筛选模型对8080个五合一样品进行筛选,最终获得19个具有抗甲病毒活性的阳性化合物。本研究所建立的抗甲病毒化合物高通量筛选模型及抗甲病毒阳性化合物的发现为抗甲病毒靶标相关的研究提供了新的思路和信息。
2015年06期 v.31 641-646页 [查看摘要][在线阅读][下载 317K]
[下载次数：185 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：2 ] - 卢莎;张玲;陶格斯;蔡敏;包丽丽;李恋;邓瑶;沈晓玲;谭文杰;
建立稳定的嵌合中国河北株包膜蛋白基因的丙型肝炎病毒(HCV)细胞培养体系,进行传代特性分析。本研究经体外转录获得嵌合中国河北株包膜蛋白基因的丙型肝炎病毒(HCV)全长RNA,脂质体法转染Huh7.5-CD81细胞,连续传代培养,进行Real Time RT-PCR、间接免疫荧光、Western blot、再感染试验与感染滴度检测及序列分析。结果表明:嵌合重组HCV RNA转染Huh7.5-CD81细胞后可产生感染性的病毒颗粒(HCVcc);传代过程中,Western blot可检测细胞内HCV蛋白的表达;IFA检测阳性细胞数逐渐增多,41d升至高峰,达80%~90%;Real Time RT-PCR检测传代细胞上清中HCV RNA拷贝数在104~107拷贝/mL;再感染实验嵌合HCVcc最高感染滴度为104ffu/mL。序列分析显示在传代后期嵌合的HCV包膜基因发生了适应性突变,导致6处氨基酸改变。结论嵌合中国河北株1b亚型包膜蛋白基因的HCV细胞培养体系可以产生具有感染性的嵌合HCV病毒颗粒,传代后感染性增强并且嵌合的HCV包膜基因发生了适应性突变。
2015年06期 v.31 647-652页 [查看摘要][在线阅读][下载 334K]
[下载次数：91 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：2 ] - 李婷;孔佳;于晓方;韩雪;
为了解人类肠道病毒68型3A蛋白可溶区的结构,本研究构建了EV-D68 3A蛋白可溶区的原核表达载体,在大肠杆菌中表达、纯化并对其结构进行了初步研究。首先,采用PCR的方法扩增EV-D68 3A(1~61)基因片段,克隆至原核表达载体pET-28a-His-SUMO中,转化进入BL21(DE3)感受态细胞,诱导表达出His-SUMO-3A(1~61)融合蛋白。经Ni-NTA树脂亲和层析初步纯化后得到大量融合蛋白,利用ULP酶酶切去除His-SUMO标签,通过Ni-NTA树脂亲和层析、阴离子交换层析柱、分子筛层析等方法分离标签并进一步纯化目的蛋白。最后通过化学交联反应检测目的蛋白的多聚化状态。结果显示,利用pET28a-His-SUMO-3A(1~61)原核表达载体能够在大肠杆菌中成功表达出大量可溶性的融合蛋白;经过多步纯化方法得到了大量高纯度的目的蛋白,平均每升大肠杆菌可得到约5mg目的蛋白,纯度达95%以上;通过化学交联反应证明了该蛋白的多聚化存在形式。本研究成功建立了EV-D68 3A蛋白可溶区的表达和纯化系统,为进一步获得3A蛋白晶体、研究3A蛋白功能以及设计以3A为靶点的抗病毒药物奠定了基础。
2015年06期 v.31 653-659页 [查看摘要][在线阅读][下载 364K]
[下载次数：210 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：3 ] |[阅读次数：3 ] - 史永林;王贤;陈国平;张进;胡万富;
研究2014年安徽省手足口病(Hand,foot and mouth disease,HFMD)患儿中分离的柯萨奇病毒A组16型(Coxsachivirus A 16,CVA16)毒株VP1区基因特征。收集安徽省2014年1月至11月期间413份HFMD患儿咽拭子标本接种敏感细胞分离肠道病毒,用荧光定量RT-PCR鉴定细胞培养物,对CVA16阳性培养物进行毒株VP1区RT-PCR扩增及核苷酸序列测定和基因特征分析,并与国内外参考序列构建基因亲缘性关系树。共分离鉴定出肠道病毒阳性培养物97份,其中CVA16病毒分离株17株,人肠道病毒71型(Human enterovirus 71,HEV71)分离株76株,其它肠道病毒分离株4株,总体病毒分离率为23.49%(97/413)。CVA16基因亲缘性关系分析显示:安徽省2014分离的17株CVA16毒株都属于B1基因型B1b一个分支,它们之间在核苷酸和氨基酸水平上的同源性分布为分别为95.30%~100%和98.70%~100%,但在B1b分支内形成几个传播链。17株CVA16毒株VP1区核苷酸序列与国内云南、湖南、广东、西藏和江苏地区病毒分离株同源性较高,亲缘性关系近,其中与湖南2013年和广东深圳2014年CVA16病毒分离株同源性最高,为96.40%~99.70%。2014年安徽省分离的CVA16病毒分离株属于B1基因型B1b亚型,为优势流行株;在B1b分支内形成多个小的病毒传播链共同流行。
2015年06期 v.31 660-664页 [查看摘要][在线阅读][下载 234K]
[下载次数：175 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：14 ] |[阅读次数：2 ] - 林亚英;温坤;郭勇晖;丘立文;潘玉先;余楠;狄飚;陈月;
登革病毒包膜蛋白(Dengue virus envelope protein,DENV E)是诱导中和抗体主要的蛋白,登革病毒包膜蛋白Ⅲ区(Dengue virus envelope protein domainⅢ,DENV EDⅢ)是构建DENV亚单位疫苗的主要靶标,但是其B细胞中和表位目前了解不多。我们采用两组覆盖DENV-1EDⅢ的重叠多肽(12肽和16肽)同27株针对DENV-1EDⅢ中和单抗反应,筛选DENV EDⅢ上B细胞表位。采用该方法,我们发现了一高度保守的Ⅰ～Ⅳ型DENV共同交叉中和B细胞表位和一高度保守的DENV-1血清型特异性B细胞中和表位,分别位于DENV-1E蛋白氨基酸残基序列第309~320位和第381~392位(Amino acid residues 309~320,and 381~392;aa 309~320和381~392)。Ⅰ～Ⅳ型DENV共同交叉中和B细胞表位在Ⅰ～Ⅳ型DENV分离株中存在高度保守共同序列310 KEVAETQHGT319,DENV-1E蛋白中E309、V312、A313和V320不影响蛋白抗原性。DENV-1血清型特异性B细胞中和表位(DENV-1E蛋白氨aa 381~392)在DENV-1分离株中高度保守,在黄病毒属其它病毒中不保守。我们也发现一具有DENV-1分离株特异性的B细胞中和表位位于DENV-1E蛋白氨基酸残基序列第329~348位。这些新发现的DENV-1E蛋白EDⅢ上B细胞中和表位可能有助于研制新的DENV亚单位疫苗。
2015年06期 v.31 665-673页 [查看摘要][在线阅读][下载 469K]
[下载次数：204 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：3 ]
- 涂梦雨;刘菲;陈舜;汪铭书;程安春;
迄今,据最新报道可感染哺乳动物和禽类的细小病毒有17余种。被感染细胞常出现不同程度的凋亡和坏死,呈现典型以细胞折光性增强、圆缩直至溶解脱落等为特征的细胞病变。NS1蛋白是细小病毒主要的非结构蛋白,其结构和功能保守,在病毒生命周期与感染宿主中扮演重要角色。它不仅影响病毒复制,还参与诱导宿主细胞凋亡。细小病毒NS1蛋白主要经由线粒体途径诱导被感染宿主细胞发生凋亡,本文全面归纳与总结细小病毒NS1蛋白诱导细胞凋亡的分子机制的最新研究进展。
2015年06期 v.31 679-684页 [查看摘要][在线阅读][下载 146K]
[下载次数：697 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：12 ] |[阅读次数：2 ] - 谢雅晶;刘贤金;
本文综述了食源性致病微生物-诺如病毒(Norovirus,NoV)在果蔬农产品中的来源和分布、在果蔬农产品中的富集情况、与果蔬农产品相关的食源性NoV暴发情况以及在农产品中的检测方法等内容。近30年来,与农产品相关的食源性NoV暴发数目持续增长。这主要与NoV的传播特性(强传染性、低感染剂量和对环境的较强抗性)以及近15年食品中NoV检测方法的显著发展有关。生鲜农产品作为高风险的食品,通常不经烹饪直接生食,在供应链中不同环节都容易被污染,如人类粪便污染的灌溉用水、肥料、食物处理用水、食物处理者的不卫生操作、交叉污染等。NoV在果蔬农产品中的结合主要与病毒颗粒的理化性质及农产品对NoV的吸附和可能的内在化途径有关。根据欧美国家与果蔬农产品有关的食源性NoV暴发的最新数据统计分析,在欧洲大规模食源性暴发主要由被NoV污染的覆盆子和生菜导致,在美国主要由被NoV污染的生菜导致。在国内,由于尚无农产品中食源性NoV检测的相关研究,缺乏与农产品相关NoV暴发的相关数据,因此无法对国内农产品中NoV的污染情况进行具体分析。农产品中NoV具有含量低且分布不均匀的特点,针对不同样品,需要采用合理的采样方法、病毒核糖核酸(Ribonucleic acid,RNA)提取方法以及实时荧光定量PCR(Real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)方法对其进行检测。根据NoV外壳蛋白的物化特性,高pH值和高离子强度的洗脱溶液(如碱性甘氨酸缓冲液等)可提高NoV的回收率;对于酸性水果中的病毒洗脱,加入三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris(hydroxymethyl)aminomethane-HCl,Tris-HCl)可以提高回收率;莓果类中含有的果胶,可在中性条件下用果胶酶去除。本文还论述了食品中食源性NoV检测的国际标准ISO/TS 15216:2013、果蔬农产品中NoV检测方法的汇总以及检测NoV的最新方法(原位杂交RT-qPCR方法),为开展农产品中NoV检测的研究提供部分参考,从而建立和发展农产品中NoV的检测方法,针对不同果蔬产品对NoV的吸附特性,配套相应NoV的提取方法,建立多种农产品中NoV常规分子检测方法,以利于对农产品安全的源头监控。
2015年06期 v.31 685-697页 [查看摘要][在线阅读][下载 278K]
[下载次数：801 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：24 ] |[阅读次数：3 ] - 刘曜综;芮萍;马芮;马增军;
伪狂犬病毒能引起多种动物伪狂犬病,严重威胁养殖业发展。尤其自2011年新毒株在我国的大面积流行,使伪狂犬病的防控研究再次成为兽医学和病毒学的热点。其中,伪狂犬病毒介导的固有免疫逃避机制是其防控困难的重要原因,对于这一问题的探讨将有助于新疫苗和特效治疗药物的研发。因此,本文旨在对伪狂犬病毒固有免疫逃避机制的研究进展进行综述,为伪狂犬病的有效防控提供理论指导。
2015年06期 v.31 698-703页 [查看摘要][在线阅读][下载 146K]
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自2004年首次发现EB病毒能够编码microRNAs(miRNAs)以来,在疱疹病毒α、β、γ三个亚科已发现超过470个miRNAs。miRNAs为内源性非编码小分子RNA,长度18-25个核苷酸,通过靶向基因转录本调控基因的表达。疱疹病毒miRNAs不仅靶向病毒潜伏到裂解复制的关键基因,也调节多个宿主基因。目前的研究数据表明疱疹病毒编码的miRNAs调节病毒的潜伏感染与裂解复制、免疫识别、细胞凋亡及肿瘤生成等生物学过程。本文旨在总结疱疹病毒miRNAs的靶基因及其功能,为深入剖析疱疹病毒的致病机制提供理论支持。
2015年06期 v.31 704-711页 [查看摘要][在线阅读][下载 234K]
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