- 李鑫娜;聂凯;王佶;张丹;关丽;刘军;柯跃华;周航宇;马学军;
鉴于目前埃博拉疫情在西非流行和输入国内的潜在风险,开发快速准确易普及的检测埃博拉病毒的方法对埃博拉防控具有重大意义。本文拟建立一种基于颜色判定简单、快速和灵敏的方法,即多引物自配引发等温扩增技术(isothermal multiple self-matching initiated amplification,IMSA)应用于埃博拉病毒扎伊尔亚型的检测。该技术设计了分别对应于埃博拉病毒扎伊尔型核蛋白(nuclear protein,NP)基因的7个区段的6条特异引物,在等温(63℃)条件下进行核酸扩增反应1小时,在扩增前加入HNB染料(羟基萘酚蓝)作为反应指示剂,以HNB染料颜色变化作为结果判定的标准。文中利用这种技术与RT-qPCR分别对含有目的片段的假病毒的系列稀释物以及模拟临床样本进行灵敏度分析,同时对30例健康人血浆以及登革病毒、日本脑炎病毒样本进行特异性分析。在塞拉利昂完成了81例埃博拉疑似病例血液样本的检测。结果显示RT-IMSA方法检测灵敏度与RT-qPCR方法的灵敏度相当,30例健康人血浆样本检测均为阴性,并且与登革病毒及日本脑炎病毒无交叉反应。与获得批准的荧光定量PCR试剂盒比较,RT-IMSA检测81例临床样本的结果为53例阳性,23例阴性,5例假阴性。灵敏度和特异性分别为91.4%和100%。因此,相较于RT-qPCR的高成本和复杂操作,RT-IMSA方法具有快速、简单的检测优势。
2016年01期 v.32 1-7页 [查看摘要][在线阅读][下载 189K] [下载次数：323 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：7 ] |[阅读次数：318 ] - 张晓光;杨韧;王娇;王轩;侯美玲;安丽娜;朱莹;曹玉玺;曾毅;
本研究利用HEK293F细胞表达了埃博拉病毒重组膜蛋白,并通过免疫小鼠初步研究了其免疫原性。按照人密码子使用频度优化编码埃博拉病毒膜蛋白胞外区基因,合成后将其插入到真核表达载体pXG-Fc中,构建埃博拉病毒糖蛋白和人IgG Fc片段融合蛋白表达质粒pXG-modGP-Fc。利用瞬时转染技术,将融合蛋白表达质粒转染到高密度培养的悬浮HEK293F细胞中,实现了分泌表达。通过Protein A亲和层析,得到了纯化的重组蛋白。将纯化的融合蛋白免疫小鼠,并通过间接ELISA对小鼠抗体效价进行评价。蛋白纯化及分析结果表明,本研究构建的真核表达系统能够有效表达埃博拉重组蛋白GP-Fc,细胞培养上清中重组蛋白以二聚体形式存在。通过间接ELISA分析,纯化的重组蛋白免疫实验动物后,可以在血清中检出高滴度的抗原特异性IgG,显示该重组蛋白具有良好的免疫原性。通过该研究,我们得到了具有良好免疫原性的重组蛋白,同时,该工作为研制基于重组蛋白的埃博拉疫苗以及筛选单克隆抗体打下基础。
2016年01期 v.32 8-13页 [查看摘要][在线阅读][下载 209K] [下载次数：420 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：7 ] |[阅读次数：254 ] - 周荣苹;孙丽娜;刘洋;芜为;李川;梁米芳;仇佩虹;
埃博拉病毒感染致死率最高可达90%,属烈性传染病,检测诊断对于疫情控制就显得异常重要。目前我国实验室通过实时定量荧光PCR检测埃博拉病毒核酸进行确诊,但耗时相对较长,对检测的人员和仪器要求较高。ELISA法检测血清是病原学诊断的主要指标,该种检测方法简单易操作,能够有效判断患者是否感染埃博拉以及感染程度,可用于流行病学调查,血清学指标的检测可以作为核酸检测的有力补充。由于埃博拉出血热在我国境内尚无病例出现,尤其需要储备血清学检测阳性质控物。通过基因工程抗体技术构建并表达抗埃博拉病毒核蛋白NP人-鼠嵌合抗体,为埃博拉出血热血清学检测做人源阳性对照储备。采用RT-PCR技术,从分泌抗埃博拉核蛋白单克隆抗体的鼠杂交瘤细胞株中分离克隆抗体轻重链可变区基因,对其进行序列分析。根据序列分析的结果,设计特异性引物将鼠源抗体可变区基因VH、VL分别克隆至携带有人抗体轻重链恒定区基因的真核表达载体HL51-14,瞬时转染293T细胞,表达并纯化获得人鼠嵌合IgG抗体,随后对其进行了免疫学检测和功能鉴定。结果表明正确构建抗埃博拉病毒核蛋白人鼠嵌合抗体真核表达载体,成功表达并纯化获得两株人鼠嵌合单抗。
2016年01期 v.32 14-18页 [查看摘要][在线阅读][下载 214K] [下载次数：420 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：248 ]
- 金聪;宋敬东;韩颖;李川;仇佩虹;梁米芳;
发热伴血小板减少综合征病毒(Severe fever with thrombocytopenia syndrome virus,SFTSV)是在我国首次发现的布尼亚病毒科白蛉病毒属的一种新型病毒,是新发传染病发热伴血小板减少综合征的致病病原。本研究通过免疫荧光共聚焦实验观察不同感染剂量和不同感染时相SFTSV核衣壳蛋白(Nucleocapsid protein,NP)在THP-1细胞内的动态定位特点,并应用电镜方法在超微结构水平观察不同感染时相THP-1细胞的胞内形态结构特征,发现SFTSV感染THP-1在胞内形成包涵体结构。研究进一步显示感染后的第3天核衣壳蛋白NP所形成包涵体的形态大小与感染后第7天培养上清中的病毒载量之间存在相关。本研究揭示SFTSV感染人源巨噬细胞THP-1形成的包涵体结构可能是SFTSV利用宿主细胞形成的特殊胞内结构以利于大量合成和产生新的病毒颗粒。
2016年01期 v.32 19-25页 [查看摘要][在线阅读][下载 545K] [下载次数：401 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：11 ] |[阅读次数：294 ] - 刘然;张桂林;刘晓明;李裕昌;郑重;孙响;杨银辉;
对新疆地区蜱传病毒类群进行调查,本研究利用Illumia深度测序技术对新疆全沟硬蜱体内的病毒小RNA分子进行筛查,从提取的蜱小RNA组份中共测得32 631条病毒特异性读序,77条读序与蜱传黄病毒基因组序列匹配,核苷酸数合计约占病毒基因组的3.8%~2.4%,其中32条读序与国内尚未发现的西伯利亚型蜱传脑炎病毒一致。为对上述结果进行确证,利用RT-PCR对此型病毒核酸进行检测,从蜱总RNA中分别扩增获得病毒包膜基因与基因组3′末端片段,测序比对表明上述片段序列与西伯利亚南部检出病毒高度近似,核苷酸与氨基酸似然率分别为97.2%~95.5%与99.4%~98.3%。综上所述,本研究利用基于深度测序的病毒筛查方法,首次从我国新疆蜱传脑炎疫源地检出西伯利亚型病毒,为下一步针对病毒的分离与流行病学调查提供了重要线索。
2016年01期 v.32 26-31页 [查看摘要][在线阅读][下载 321K] [下载次数：333 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：16 ] |[阅读次数：193 ] - 邹小辉;肖蓉;郭小娟;屈建国;鲁茁壮;洪涛;
为了探索腺病毒感染细胞后病毒核心在胞内运输的过程,本研究构建了一株经miniSOG标记IX蛋白的人腺病毒。首先,我们通过重叠延伸PCR的方法合成了miniSOG基因,将其克隆至pcDNA3表达载体后转染293细胞,荧光显微镜下可观察到miniSOG蛋白的表达,经固定,封闭,DAB-H2O2染色,OsO4固定染色后,可见表达miniSOG蛋白的细胞呈深褐色。之后将miniSOG构建至腺病毒穿梭载体pShuttle的IX基因3’端,并通过与骨架质粒pAdeasy-1在E.coli BJ5183细菌内同源重组获得了重组腺病毒质粒pAd5-IXSOG。pAd5-IXSOG质粒经PacI酶切线性化后转染293细胞,拯救出重组腺病毒HAdV-5-IXSOG。经过8轮扩增,超速离心纯化后获得2.0ml浓度为6.0×1011vp/mL的重组腺病毒,电子显微镜下可见完整病毒颗粒。本研究经反向遗传学技术对腺病毒载体进行改造,成功制备了经miniSOG标记的重组腺病毒HAdV-5-IXSOG,该病毒可用于腺病毒感染细胞的实时追踪。
2016年01期 v.32 32-38页 [查看摘要][在线阅读][下载 310K] [下载次数：144 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：5 ] |[阅读次数：323 ] - 杨少华;许传田;张琳;黄艳艳;黄庆华;胡北侠;张秀美;
小干扰RNA(siRNA)诱导的RNA降解可以特异性地抑制病毒感染,它作为一种有效的抗病毒治疗方法正被广泛研究。为了探讨慢病毒介导的shRNA对NDV复制的抑制效果,从而为新城疫病毒的抗病毒研究奠定基础,本研究以新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)P基因为靶基因,构建了靶向NDV P基因的shRNA重组慢病毒表达载体RNAi-341和RNAi-671。将其与辅助细胞共转染293T细胞,获得包装好的重组慢病毒;在鸡胚成纤维细胞(Chicken embryo fibroblast,CEF)和SPF鸡胚上进行了干扰实验,并通过荧光定量PCR和病毒滴度测定检测shRNA对NDV的抑制效果。结果发现,RNAi-341和RNAi-671均能抑制FLAG-P蛋白在293T细胞中的瞬时表达。在CEF细胞感染后16h后,NDV的病毒滴度分别降低了66.6倍和30.6倍;在鸡胚感染48h后,RNAi-341和RNAi-671组NDV病毒的增殖量分别减少99%和98%。RNAi-341与RNAi-671不仅能抑制P基因的转录,还能显著降低NP、M、F、HN和L基因的转录水平。与RNAi-671相比,RNAi-341的抑制效果更好。研究结果表明,慢病毒介导的靶向P基因的shRNA具有抗病毒作用,能够抑制NDV在CEF和鸡胚中的复制,从而为临床防治NDV提供一个新方法。
2016年01期 v.32 39-45页 [查看摘要][在线阅读][下载 226K] [下载次数：178 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：228 ] - 申艳玮;何孟莲;张吉;赵满达;王桂花;成子强;
禽白血病病毒J亚群(ALV-J)为致瘤性禽反转录病毒,主要引起髓细胞瘤。ALV-J囊膜基因的高频突变率使其具有了跨种传播的潜力。为探索ALV-J在宿主选择压力下是否可实现跨种传播,本研究以ALV-J顺次感染易感宿主禽(SPF鸡,火鸡),然后过渡到抗性宿主禽(山鸡,鹌鹑和鸭),检测排毒规律、观察病理变化、分析分离株囊膜基因(env)遗传突变。结果显示,通过对ALV-J体内选择压的逐级建立,实现了对抗性宿主山鸡和鹌鹑的感染,但鸭未感染,而用原代毒直接攻毒抗性禽则未出现感染。SPF鸡和火鸡感染率均为100%(16/16),而山鸡和鹌鹑的感染率分别为37.5%(6/16)和10%(3/30)。感染宿主均呈免疫耐受状态,并可见肝脏、脾脏、肾脏及心血管系统炎症反应和组织损伤。通过有义突变与沉默突变比值(NS/S)分析,山鸡毒株和鹌鹑毒株超变区hr2的NS/S值均为2.5,由此可知山鸡和鹌鹑ALV-J分离株的突变是由宿主选择压造成的,且提示hr2区突变是ALV-J实现跨种传播的关键区域。序列同源性分析发现火鸡、山鸡和鹌鹑ALV-J分离株与原始毒逐渐远离,而与ALV-J原型株HPRS-103株却呈接近趋势,但HPRS-103不感染山鸡和鹌鹑,其机制还有待于进一步研究。
2016年01期 v.32 46-55页 [查看摘要][在线阅读][下载 714K] [下载次数：294 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：12 ] |[阅读次数：373 ] - 耿合员;汪圣强;谢晓谦;肖雨;张汀;谭文杰;苏川;
建立了一种适合于国境口岸简便、快速、灵敏和特异检测人冠状病毒NL63(HCoV-NL63)的核酸检测方法。通过建立基于颜色判定的逆转录环介导等温扩增(Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)技术,针对HCoV-NL63核衣壳蛋白(Nucleocapsid,N)基因序列设计出6条特异性引物,在等温条件下(63℃)进行扩增反应60min,在扩增前加入钙黄绿素作为反应指示剂,并结合浊度仪进行实时监测,以最终反应颜色变化作为结果判断标准。利用该方法对同种属其他人冠状病毒、诺如病毒、流感病毒进行检测,以分析该方法的诊断特异性。应用该方法对梯度稀释的HCoV-NL63病毒RNA进行检测,以分析该方法的诊断灵敏性,并与常规real-time RT-PCR方法进行比较。结果显示,本研究建立的基于颜色判定的RT-LAMP方法在短时间内(40min)即可达到对HCoV-NL63的快速检测。该检测方法与加入其它病毒RNA模板溶液颜色均不产生改变,具有较高的检测特异性。检测灵敏性最低检测下限为1 600拷贝/反应。本研究建立的基于颜色判定的RT-LAMP方法可实现对HCoV-NL63冠状病毒现场快速检测,具有在国境口岸以及基层医疗机构和疫区现场推广应用的潜力。
2016年01期 v.32 56-61页 [查看摘要][在线阅读][下载 197K] [下载次数：294 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：8 ] |[阅读次数：423 ] - 张丽华;吴翠兰;张志鹏;何怡宁;李和鸣;秦丽莉;韦天超;磨美兰;韦平;
为继续跟踪了解近年来广西鸡传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus,IBV)的流行状况及抗原变异情况,本研究对2012~2013年的15个广西IBV分离株S1基因进行了相似性比较、进化树和重组分析,同时鉴定了分离株的血清型。结果表明,15个IBV毒株之间的S1基因氨基酸序列相似性为54.3%~99.6%,与参考株的相似性为43.3%~99.3%;除GX-YL130025外,其余14个毒株与疫苗株H120的相似性均较低(65.1%~81.4%);进化树分析表明,15个IBV分离株分属8个基因型,其中New-type II为优势基因型;重组分析表明,分离株GX-NN130048的S1基因来源于4/91疫苗株和LX4型野毒株的重组;血清分型结果表明,15个IBV分离株分属7个血清型,与生产上广泛使用的疫苗株H120血清型一致的仅有1株,重组毒株GX-NN130048的血清型不同于其亲代血清型。本研究表明,近年广西地区IBV不管是在基因型还是血清型上都发生了明显的变异,同时存在多个基因型和血清型的流行;基因重组可导致新血清型的出现,这可能是导致免疫失败的主要原因。本研究为全面阐述IBV变异规律和分子机制以及为新疫苗的研发提供依据。
2016年01期 v.32 62-69页 [查看摘要][在线阅读][下载 222K] [下载次数：470 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：24 ] |[阅读次数：349 ] - 于杨;斯玮瑛;袁庄川;颜焰;周继勇;
本研究从人感染H7N9活禽交易市场的鹌鹑体内分离到1株H9N2亚型流感病毒并命名为A/Quail/Hangzhou/1/2013(H9N2),并分析了该毒株的基因组特性及其对鸡的致病力。序列分析结果显示:基因组中HA、NS基因属于类CK/BJ/1/94分支,NA、NP、PA、PB1基因属于类SH/F/98分支,M和PB2属于类G1/97分支。关键氨基酸位点分析结果显示:HA的裂解位点为PSRSSR↓GL,HA蛋白具有人样流感病毒受体结合位点Leu226,NA颈部出现63-65位氨基酸的缺失,M2蛋白Asn31和NS1蛋白Ser42、Ala149发生了突变。该毒株的IVPI为0.36。雏鸡感染性试验的结果显示:所有接种鸡在感染后的第3天从呼吸道和消化道都可检测到排毒,直至第11天停止排毒。同居感染动物于放入后的第2天达到排毒高峰,排毒率为100%,持续至第8天停止排毒。感染动物的病毒再分离结果显示:肺和气管的带毒时间可达5天,其他组织为3天。以上结果表明:该毒株是一株H9N2大陆流行谱系的低致病性禽流感病毒。本研究为H9N2亚型禽流感病毒的预防和监控提供了一定的理论依据。
2016年01期 v.32 70-76页 [查看摘要][在线阅读][下载 378K] [下载次数：372 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：3 ] |[阅读次数：231 ] - 蓝佳明;卢帅;邓瑶;文波;陈红;王文;谭文杰;
筛选有效的免疫原,研制安全有效的疫苗,是预防中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus,MERS-CoV)感染的有利武器。本研究应用生物信息学方法,预测了MERS-CoV棘突蛋白(Spike,S)上的多肽抗原表位。基于生物信息学分析结果人工合成9条多肽并偶联钥孔戚血蓝素后,分别免疫BALB/C小鼠,检测了多肽诱导的体液免疫和细胞免疫应答。结果表明,YVDVGPDSVKSACIEVDIQQTFFDKTWPRPIDVSKADGI的多肽,三次免疫小鼠后,可在小鼠体内诱导较强的IgG抗体(滴度达1∶10 000)和较高水平的抗原特异性细胞免疫应答。本研究结果为基于生物信息学预测的多肽疫苗的设计及MERS-CoV疫苗的研制提供了科学参考。
2016年01期 v.32 77-81页 [查看摘要][在线阅读][下载 156K] [下载次数：390 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：4 ] |[阅读次数：273 ]
- 高慧慧;陶然;俞惠民;尚世强;
人巨细胞病毒(HCMV)的潜伏感染在人群中极为普遍。在儿科学领域,潜伏感染的巨细胞病毒激活后,可能导致死胎、流产、胎儿畸形、生长发育迟缓等一系列严重后果。在病毒潜伏感染过程中,机体会通过免疫反应或诱导宿主细胞凋亡等方式清除病毒。然而,在病毒与宿主共同进化的漫长过程中,病毒会调控自身基因的表达、宿主细胞微环境及免疫杀伤作用,从而达到与长期宿主共存的目的。目前研究揭示,HCMV的潜伏感染可能与病毒立即早期启动子沉默、病毒干扰宿主细胞凋亡、病毒免疫逃逸及非编码RNA调控机制有关。本文将从以上四个方面对HCMV潜伏感染相关机制的研究进展进行总结。
2016年01期 v.32 82-87页 [查看摘要][在线阅读][下载 144K] [下载次数：1242 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：26 ] |[阅读次数：260 ] - 张晓红;王涛;于晓方;
至今,艾滋病仍是人类历史上最严重的传染病之一。设计和生产具有保护效力的预防型HIV-1疫苗一直被认为是战胜艾滋病的最佳途径。虽然经过了数十年的努力,但有效的HIV-1疫苗仍未研制成功。在进入临床试验的5种疫苗中,只有RV144实验显示出31%的保护效力,但并不能控制已感染者病情进程。通过临床实验数据和体外实验分析,目前主要有两种免疫原设计策略:诱导广谱中和抗体(bNAb)和有效的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答。诱导bNAb可以阻止病毒感染或者降低感染率,其主要免疫原包括:病毒样颗粒、天然包膜蛋白三聚体和稳定的bNAb结合表位等。而诱导有效的CTL应答可以减缓病毒感染进程,其主要免疫原包括:"马赛克"疫苗、保守区免疫原和病毒适应性图谱指导的免疫原等。本文将主要阐述这两种免疫原设计策略及其研究进展。
2016年01期 v.32 88-92页 [查看摘要][在线阅读][下载 127K] [下载次数：939 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：4 ] |[阅读次数：232 ] - 朱士茂;李慧;
杆状病毒是一类专一性感染节肢动物的病原微生物,在其生活周期中产生两种不同形态的病毒粒子,即芽生型病毒粒子和包埋型病毒粒子。自然界中,杆状病毒通过经口感染的方式在其宿主的中肠中建立原发性感染,杆状病毒的包埋型病毒粒子在此过程中发挥关键作用。本文回顾了杆状病毒的基本特性,阐述杆状病毒包埋型病毒粒子的蛋白组成及分类,并着重介绍多粒包埋型病毒粒子的进化及在杆状病毒经口感染过程建立中的意义,对进一步了解杆状病毒的进化历程和侵染机制具有重要的指导意义。
2016年01期 v.32 93-100页 [查看摘要][在线阅读][下载 168K] [下载次数：354 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：9 ] |[阅读次数：161 ] - 奉代燊;贾仁勇;
疱疹病毒是一种由双链DNA病毒组成的大家族,包括α-、β-和γ-三个亚科,其糖蛋白gB、gH和gL形成细胞融合的"核心融合机制"。有些疱疹病毒还需要其他糖蛋白(HSV的gD、EBV的gp42和HCMV的gO、UL128-131)的调节作用,促进细胞融合。而糖蛋白gM或gM/gN却对细胞融合具有抑制作用。本文对疱疹病毒糖蛋白介导的细胞融合机制进行阐述,为进一步研究病毒致病机理提供一定的理论依据。
2016年01期 v.32 101-107页 [查看摘要][在线阅读][下载 156K] [下载次数：428 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：8 ] |[阅读次数：210 ] - 郑树城;王庆;李莹莹;曾伟伟;王英英;刘春;梁红茹;石存斌;
鲤疱疹病毒3型(Cyprinid herpesvirus 3,CyHV-3)是引起高度传染性锦鲤疱疹病毒病(Koi herpesvirus disease,KHVD)的病原,该病毒自1997年首次报道以来,在全球多个国家传播、流行,范围覆盖亚洲、欧洲、北美及非洲多个国家,给鲤鱼及锦鲤养殖业造成无可估量的经济损失。本文就鲤疱疹病毒3型的病原学、流行病学、感染机制、诊断及防控等方面的研究进行简要综述,以期为鲤疱疹病毒3型基础研究和疾病防控策略的建立提供参考信息。
2016年01期 v.32 108-120页 [查看摘要][在线阅读][下载 409K] [下载次数：867 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：28 ] |[阅读次数：214 ] - 张硕;李德新;
寨卡病毒自1947年首次在乌干达被发现以来,已经在非洲、东南亚和美洲等地造成多次暴发流行,且在中国已有输入性寨卡病毒感染病例的报道。寨卡病毒为黄病毒科黄病毒属,存在非洲型和亚洲型两个亚型。寨卡病毒主要依赖感染病毒的伊蚊类蚊媒叮咬传播,也可通过母婴传播以及血液和性传播。寨卡病毒感染人体后经血播散并可跨越血脑屏障进入中枢神经系统,患者一般临床症状较轻,但有可能出现格林巴利综合症,婴儿小头畸形也与寨卡病毒感染孕妇有关。寨卡病毒的实验室诊断主要包括核酸检测、血清学检测和病毒分离。目前尚无有效疫苗预防寨卡病毒感染,主要预防措施包括防蚊控蚊和提高个人防护意识,并在重点地区加强病例监测。
2016年01期 v.32 121-127页 [查看摘要][在线阅读][下载 224K] [下载次数：5447 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：66 ] |[阅读次数：999 ] 下载本期数据