武汉生物制品研究所有限责任公司病毒性疫苗研究二室;中国食品药品检定研究院呼吸道病毒疫苗室;北京生物制品研究所课题一组;长春生物制品研究所有限责任公司疫苗研究室;
建立一种新型冠状病毒（Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2）S1、S2、NTD蛋白特异性B细胞及其亚型的标记技术，该技术可通过与流式细胞术联用检测抗原特异性B细胞及其亚型含量，或与10×免疫组库联用对抗原特异性B细胞进行测序。首先，测试最佳蛋白使用浓度：将生物素标记的S1、S2和NTD蛋白按照600 nmol/L、1 200 nmol/L、2 400 nmol/L、3 600 nmol/L和4 800 nmol/L分别与荧光素-亲和素偶联，通过流式检测S1+CD19+B、S2+CD19+B、NTD+CD19+B细胞占比，确定不同蛋白对应的最佳使用浓度；进一步优化生物素-蛋白与荧光素-亲和素的比例：将检测生物素-蛋白与荧光-亲和素的摩尔比分别按照4∶1,5∶1和6∶1比例测试，对小鼠脾脏S1+CD19+B、S2+CD19+B、NTD+CD19+B细胞及S1+CD19+CD27+B、S2+CD19+CD27+B、NTD+CD19+CD27+B细胞的检测效果，优化荧光素-亲和素的最佳使用量；通过测试BV421、Super Bright 600、PE、PE/Cy7和APC等荧光对小鼠脾细胞的非特异结合能力，选择非特异结合较弱的荧光；根据筛选的荧光，给生物素化的S1、S2和NTD均标记PE和APC荧光，建立检测这3个蛋白特异性B细胞和记忆B细胞的方法，并测试带核酸序列的荧光素-亲和素对B细胞和记忆B细胞的检测效果，测试该方法的稳定性。S1、S2和NTD蛋白浓度分别为4 800 nmol/L、3 600 nmol/L和3 600 nmol/L时，对B细胞的检测效果最佳，且对阴性小鼠的染色效果较低；生物素-S1蛋白与荧光素-亲和素的最佳摩尔比为6∶1时，检测结果最佳；生物素-S2蛋白、生物素-NTD蛋白与荧光素-亲和素均在4:1时，检测结果最佳，且在该浓度下BV421、APC、Super Bright 600、PE与细胞的非特异结合较弱；建立了一种检测SARS-CoV-2 S1、S2和NTD抗原特异性B细胞及记忆B细胞的方法，通过对一批样本的重复3次检测，发现该方法较为稳定，CV值≤20%。通过抗原特异性B细胞标记技术，实现了对SARS-CoV-2S1、S2和NTD蛋白特异性B细胞及其亚型标记技术方法，并且具有良好的适用性，可用于与流式细胞术检测抗原特异性B细胞及记忆B细胞和10×免疫组库测序联合使用。
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[2] Zhang J, He Q, An C, et al. Boosting with heterologous vaccines effectively improves protective immune responses of the inactivated SARS-CoV-2vaccine[J]. Emerg Microbes Infect, 2021, 10(1):1598–1608. DOI:10. 1080/22221751. 2021. 1957401.
[3] Kaku CI, Champney ER, Normark J, et al. Broad anti–SARS-CoV-2 antibody immunity induced by heterologous ChAdOx1/mRNA-1273 vaccination[J].Science, 2022, 375(6584):1041–1047. DOI:10. 1126/science. abn2688.
[4] Ai J, Guo J, Zhang H, et al. Cellular basis of enhanced humoral immunity to SARS-CoV-2 upon homologous or heterologous booster vaccination analyzed by single-cell immune profiling[J]. Cell Discov, 2022, 8(1):114.DOI:10. 1038/s41421-022-00480-5.
[5] He Q, Mao Q, An C, et al. Heterologous prime-boost:breaking the protective immune response bottleneck of COVID-19 vaccine candidates[J]. Emerg Microbes Infect, 2021, 10(1):629–637. DOI:10. 1080/22221751. 2021. 1902245.
[6] Setliff I, Shiakolas AR, Pilewski KA, et al. Highthroughput mapping of B cell receptor sequences to antigen specificity[J]. Cell, 2019, 179(7):1636-1646.e15. DOI:10. 1016/j. cell. 2019. 11. 003.
[7] He B, Liu S, Wang Y, et al. Rapid isolation and immune profiling of SARS-CoV-2 specific memory B cell in convalescent COVID-19 patients via LIBRA-seq[J]. Signal Transduct Target Ther, 2021, 6(1):195.DOI:10. 1038/s41392-021-00610-7.
基本信息:
DOI：10.13242/j.cnki.bingduxuebao.004548
中图分类号:R392-33
引用信息:
[1]宋彦丽,杨惠洁,赵玉秀等.新型冠状病毒S1、S2和NTD抗原特异性B细胞及其亚型标记技术的建立与应用[J].病毒学报,2024,40(04):679-686.DOI:10.13242/j.cnki.bingduxuebao.004548.
基金信息: