2025年 03期
肠道病毒D68型流行基因型高灵敏通用型Real-time RT-PCR检测方法建立及应用
肖梦怡;韩振志;路环环;丛如意;冀天娇;祝双利;孙强;刘莹;周蕾;栗凡;梁钰材;范华;肖金波;张勇;自2014年肠道病毒D组68型(Enterovirus D68,EV-D68)引起急性弛缓性脊髓炎暴发以来，一直被广泛关注。建立一种快速、高效且便捷的EV-D68特异性Real-time RT-PCR检测方法，对于及时发现潜在的传染源并迅速阻断传播至关重要。本研究参考EV-D68各个基因型VP1区代表序列设计探针和引物，通过制作标准品，对其特异性、灵敏度以及重复性进行全面评价，并用临床样本检测其可靠性。结果显示，本研究所设计的探针和引物仅能检出EV-D68，其他73种血清型肠道病毒均无检出情况，最低检测下限为2×101拷贝/μL，拷贝数与循环阈值之间具有良好的线性关系(R2=0.9933)，重复性检测的变异系数小于1.70%，稳定性良好。采用本研究设计的探针和引物对41份临床样本进行检测时，实现了零漏检，与测序的金标准结果完全吻合，对于目前流行的B3和D3基因亚型可以实现全覆盖。综上所述，本研究设计的特异性探针引物在EV-D68检测中展现出高效且准确的特性，同时对目前流行的基因型具有较强的通用性，能够为EV-D68感染的临床诊断、疫情监测以及流行病学调查工作提供有力支持，为EV-D68的快速鉴定和相关疾病防控提供关键技术支撑。
2023年河南省急性弛缓性麻痹病例中非脊髓灰质炎肠道病毒病原学及流行病学分析
杨建辉;张明瑜;张璐;豆巧华;白祎然;马雅婷;郭永豪;张勇;为了解2023年河南省急性弛缓性麻痹（Acute flaccid paralysis,AFP）病例中非脊髓灰质炎肠道病毒（Nonpolio enterovirus,NPEV）的病原学及流行病学特征，为AFP的防控以及治疗提供理论支持。本研究采集2023年报告的AFP病例双份粪便标本进行病毒分离培养，对检出的NPEV毒株VP1区进行核苷酸序列测定和分析，使用mafft v7.526和MEGA 5.1软件对序列进行比对和遗传进化分析。使用SPSS 26软件对数据进行统计分析。结果显示2023年河南省报告706例AFP病例，报告发病率为3.13/10万，共检出25株NPEV，检出率为3.54%(25/706），其中20株为A组肠道病毒（Enterovirus A,EV-A），占比为80%,5株为B组肠道病毒（Enterovirus B,EV-B），占比为20.00%，未检出C组和D组肠道病毒。EV-A中共有6个血清型，其中柯萨奇病毒A4(Coxsackievirus,CVA4）检出数最多（均为C基因型），检出率为35.00%(7/20），其次为CVA10（均为C基因型），检出率为30.00%(6/20),EV-B均为CVB2（均为D基因型），三种血清型均与手足口病例中检出的的毒株关系较近。不同人群之中，3～5岁组AFP病例报告率最高，为30.45%(215/706),0～2岁组中NPEV检出率最高，为5.46%(10/183），男女发病数比为1.37:1，不同性别之间NPEV检出率差异无统计学意义（P>0.05）。在地区分布上，EV-A分布最为广泛，其中CVA4主要分布在豫北、豫中和豫西，CVA10主要分布在豫北、豫中和豫南，EV-B主要分布在豫东和豫南。在时间分布上，夏秋两季检出率较高，冬春季检出率相对较低，其中EV-A呈现双峰，最高峰出现在10月份，EV-B主要发生在6-8月份。以上结果表明，2023年河南省分离的NPEV以EV-A中的CVA4和CVA10为主要血清型，且分布最为广泛，相比往年以EV-B为主要血清型发生了显著变化，后期应继续对NPEV进行监测，为NPEV可能引起的疾病的暴发流行预测预警提供基线数据。
2018-2023年新余地区手足口病流行特征及其CVA6型病毒分子特征研究
潘虹;陈小玲;文奇;刘娇;廖秀海;为了研究新余地区手足口病(Hand foot and mouth disease,HFMD)的流行特征和优势株的分子特征，掌握HFMD在新余地区的流行趋势及变迁规律。收集2018-2023年新余地区疑似HFMD咽拭子标本476份，应用实时荧光定量PCR(RT-PCR)进行核酸检测，分析病原体类型和流行情况，挑选22株柯萨奇病毒A组6型(Coxsackievirus A6,CVA6)病原体样本进行VP1基因扩增，用Blast进行序列比对分析，用MEGA 11构建系统发育树。新余地区2018-2023年HFMD阳性检出率为36.97%，其中优势型别CVA6的阳性检出率为31.72%，占阳性总数的85.80%。2019年和2022年HFMD阳性率较低，与2023年差异具有统计学意义(χ2=33.000,P<0.05)，其他年度之间无差异。2018-2023年HFMD具有季节性，除2020年外，发病高峰均集中在4～6月份，易感年龄是5岁以下，男女易感性无差别。2019-2021年90%以上的HFMD阳性病例为CVA6型，2022-2023年均为CVA6型，2018年为柯萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus A16,CVA16)和CVA6型交叉流行，未发现其它型别。22株CVA6均属于D3基因亚型，它们的VP1基因核苷酸和氨基酸相似性比较高，分别为91.91%～100%和92.88%～100%，但发现39个(12.70%,39/307)氨基酸变异。2019-2023年新余地区HFMD的绝对优势病原体为CVA6型，发病具有明显的季节性和人群特征，春夏之交应加强5岁以下儿童的HFMD防控。22株CVA6均为D3亚型，不同年份间形成多个小分支，表明新余地区CVA6存在VP1基因多样性的进化趋势，应进一步加强新余地区优势病原体CVA6流性特征及分子特征分析。本研究可为制定新余地区手足口病防控策略和疫苗研究提供依据。
MPXV的流行动态、遗传演化分支及其公共卫生安全挑战
景伟;陈国华;房永祥;何小兵;景志忠;猴痘（Monkeypox,Mpox）是由猴痘病毒（Mpox virus,MPXV）感染引起的一种以发热、皮疹和淋巴结肿大为特征的病毒性人兽共患病，近3年内两次被WHO认定为“全球关注的突发公共卫生事件”，分别由MPXV进化亚支Ⅱb和Ⅰb毒株谱系引起，并在世界范围内暴发流行，其中MPXV进化亚支Ⅱb毒株曾在我国输入性感染和本土隐秘性传播，波及全国至少25个省市区，目前MPXV进化亚支Ⅰb毒株也输入我国，并造成密切接触感染形成二代病例，这对我国公共卫生安全构成了巨大的威胁和挑战。该文通过对MPXV的流行动态以及不同遗传进化亚支毒株和生物学特性的介绍，探讨其从动物到人类适应后在人际间共流行的趋势和危害，为Mpox防控和公共卫生风险应对提供依据。
猴痘病毒对雌兔和雄兔致病差异研究
师少文;王笑焓;聂小萱;任文浩;王玉星;孙雍阳;何曼琳;郭振东;李霄;史万玉;赵宗正;研究猴痘病毒对雌兔和雄兔的致病差异。将猴痘病毒（Monkeypox Virus,MPXV）分别感染雌兔和雄兔，监测兔子的体重、体温和临床症状，检测MPXV在雌兔与雄兔各组织脏器中的分布，并通过病理切片观察皮肤组织的病理学变化。雌兔和雄兔感染MPXV后均会出现体温升高、体重下降和皮肤皮疹，但与雄兔相比，雌兔体温升高幅度更大、持续时间更长、体重下降幅度更大、皮疹范围更广及皮肤组织病变更严重。MPXV可感染雌兔和雄兔，且对雌兔致病性更强。
基于悬浮芯片技术的新冠病毒多抗原多亚型抗体快速检测方法的建立及应用
房美钰;张乔;郭丽;任丽丽;本研究针对病毒多抗原、多抗体亚型检测的需求，基于悬浮芯片技术建立了一种可同时检测多种抗原蛋白多种抗体亚型的多重检测方法，为血清抗体特征的评估提供了一种高通量、快速的技术手段。以新冠病毒为研究模型，选用荧光编码微球作为反应载体，通过化学偶联技术将新冠病毒的核衣壳蛋白（Nucleocapsid, N）、刺突蛋白S2亚基（spike S2, S2）、受体结合域（Receptor binding domain, RBD）以及N端结构域（N-terminal domain, NTD）固定于微球表面。优化血液样本的稀释倍数和与微球的孵育时间后，采用生物素标记的小鼠抗人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亚型抗体作为检测二抗，建立针对各IgG亚型的标准品体系，并根据中位荧光强度（Median FluorescenceIntensity, MFI）对血样中的抗体亚型进行定量分析。所建立的检测体系可同时实现对SARS-CoV-2的N、NTD、RBD及S2四种抗原IgG亚型抗体的检测。其中，N-IgG1、NTD-IgG1、RBD-IgG1和S2-IgG1的检测灵敏度分别为84.38%、93.75%、90.63%和96.88%，特异度分别为100%、94.44%、100%和100%。本研究成功构建了一种基于悬浮芯片的多重检测体系，能够高效检测新冠病毒N、NTD、RBD与S2四种抗原对应的IgG亚型，适用于血样中抗体亚型分布特征的通量分析。
实时荧光定量PCR与酶法预处理联合应用对H9N2禽流感病毒灭活效果评价的初步研究
王慧;王明明;张杰琼;王娇;李颖;王大燕;王世文;卢学新;董婕;本研究旨在建立一种快速、准确的禽流感病毒灭活效果评价方法。传统方法通过鸡胚繁殖或细胞培养对禽流感病毒灭活效果进行定量检测，但存在操作时间长且无法客观反映残余病毒量的局限性。实时荧光定量逆转录PCR(RT-qPCR)虽可作为直接定量消毒剂作用后的残余病毒量的一种方法，但无法评估病毒的感染性。本研究将RT-qPCR技术与酶法预处理相结合，对中低效消毒剂新洁尔灭和75%乙醇灭活H9N2病毒的效果进行评估。结果显示，333 U/mL的蛋白酶K处理30 min，可有效降解受损的病毒囊膜蛋白；随后使用0.2 mg/mL的RNase A处理30 min，可降解裸露的病毒RNA。1%和0.25%的苯扎溴铵分别作用5 min后，经酶法预处理联合RT-qPCR检测，病毒基因组水平分别降低5.67和5.62 lg拷贝数/μL;75%乙醇作用1 min，病毒基因组水平降低5.65 lg拷贝数/μL；作用时间延长至5 min时，病毒基因组水平降低至检测值以下。本研究通过RT-qPCR联合酶法预处理建立了定量评价苯扎溴铵和75%乙醇有效灭活H9N2禽流感病毒的方法 。
2022年1月-2023年6月北京地区儿童急性呼吸道感染人偏肺病毒分子流行特征分析
黄陆慈;郭雅洁;申晨;李飞;付艺亮;张瀚文;许黎黎;孙琳;陈祥鹏;谢正德;人偏肺病毒(Human metapneumovirus,h MPV)是引起儿童急性呼吸道感染(Acute respiratory tract infections,ARTIs)的常见病毒病原体。本研究通过分析2022年1月至2023年6月北京地区ARTIs患儿感染h MPV分子流行病学特征，为h MPV流行监测、防控提供基础数据。2023年5至6月，h MPV RNA阳性患儿人数激增，h MPV RNA检出率可达6.39%。h MPV RNA阳性住院患儿发病年龄的中位数为3.8岁；多数住院患儿诊断为肺炎，36.62%的患儿进展为重症肺炎。本研究共获得49例流行株G基因序列，系统进化树分析提示45例属A2c111nt-dup基因亚型、3例属B1基因亚型和1例属B2基因亚型，检出的流行株与国内外其他地区的流行株存在交叉流行。G基因与A2c111nt-dup、B1和B2基因亚型的代表株相比，其核苷酸(氨基酸)序列同源性分别为92.7%～96.8%(86.3%～93.7%)、89.7%～90.2%(85.3%)和92.2%(88.0%)。其中，A2c111nt-dup基因亚型流行株PP69162与其他株相比，其G蛋白新增I/M55L、Q56R、K57A和S60C氨基酸位点改变。A2c111nt-dup和B1基因亚型G蛋白的N-糖基化位点和O-糖基化位点较参考株而言，均有所增加，提示h MPV基因组仍不断发生变异。2023年5至6月出现的h MPV感染ARTIs患儿人数激增、检出率升高提示儿童h MPV感染可能存在流行趋势。此外，尽管A2c111nt-dup基因亚型仍是北京地区流行的优势型别，但G蛋白仍存在不断地变异过程，持续动态监测不同基因亚型h MPV感染的临床表现和h MPV分子流行特征具有重要意义。
安徽省不同区域新冠病毒奥密克戎变异株分子流行病学特征分析
刘涓涓;吴小珉;宋永庆;王祥英;郭靓子;项可霞;栗薇薇;黄进宝;李卫东;为了解安徽省新型冠状病毒（SARS-CoV-2）奥密克戎变异株流行趋势和进化规律，本研究选取了2023年3月至9月安徽省皖北、皖中和皖南地区共计365份本土新冠病毒感染确诊病例，利用高通量测序技术开展SARS-CoV-2全基因组测序。将获得的高质量序列通过Pangolin和Nextclade网站对SARS-CoV-2分型和突变位点进行统计分析。监测期间安徽省不同区域奥密克戎变异株构成存在时间差异：在监测前期到中期，皖北地区优势株由XBB.1.16及其亚分支发展为XBB.1.22及其亚分支；皖中地区由BA.5.2及其亚分支发展为FE.1及其亚分支；而皖南地区由XBB.1.22及其亚分支发展为FE.1及其亚分支，在监测后期不同区域优势株均以EG.5及其亚分支占主导。受到地理文化气候等多因素影响，不同区域的变异株构成也存在空间差异，合肥市和亳州市的奥密克戎变异株亚型相对更多。安徽省不同区域奥密克戎变异株基因组平均核苷酸突变位点数随时间逐渐增加，主要伴随着S蛋白的突变。本研究结合安徽省区域特征分析了奥密克戎变异株的流行特征，为新冠病毒感染防控措施的制定提供重要理论支持。
基于SFTS患者血清学指标与机器学习的轻重症分类模型研究
闻闫瀚;田婷婷;黄晓霞;刘铁柱;芜为;孙丽娜;李建东;李德新;梁米芳;李阿茜;王世文;近年来，发热伴血小板减少综合征（Severe fever with thrombocytopenia syndrome, SFTS）传播范围不断扩大，给公众健康构成严重威胁。目前，尚无特异性治疗药物或已上市疫苗，主要靠对症支持治疗。早期识别重症患者并实施有针对性的干预，往往是降低病死率的关键。我们将91例SFTS患者的急性期血清抗体、细胞因子和相关实验室指标联合分析，通过机器学习的方法，构建出多因素Logistic回归、随机森林、支持向量机和XGBoost四种早期患者轻重症分类模型。在变量筛选阶段，我们依次使用单因素Logistic回归，多重共线性诊断和LASSO回归筛选变量，得到IL-10、IFN-γ、IFN-α、IL-8、AST、IgM OD450、TP和LY%共8个建模变量。结果显示，在早期轻重症分类中表现最佳的是随机森林（AUC=0.889），接下来是多因素Logistic回归（AUC=0.822）以及XGBoost(AUC=0.811)，而表现相对较差的是支持向量机（AUC=0.744）。此外，我们借助多因素Logistic回归识别出IFN-γ、IL-8、IgM OD450和LY%四种SFTS重症化独立预测因子。随机森林和XGBoost的变量重要性分析均表明，IL-10可能是最重要的预测因子，且IFN-γ、IL-8和AST也有较高的重要性。本研究基于血清学指标与机器学习方法开展SFTS患者轻重症分类模型的研究，为SFTS早期风险评估提供了新思路。