2026年 02期
埃可病毒30型关键宿主因子TMEM240的鉴定及作用机制研究
李冀琛;段伟;李慧洁;王蕊;孙强;张勇;目的 埃可病毒30型（Echovirus30, E30）作为肠道病毒B家族的重要成员，是引起无菌性脑膜炎、脑炎的主要病原体之一；目前在亚洲、欧洲以及南美洲呈季节性和周期性流行。然而，针对E30参与宿主感染的相关机制知之甚少。规律成簇间隔短回文重复/CRISPR相关核酸酶9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeat/CRISPR-associated nuclease 9, CRISPR/Cas9)系统已经被广泛用于对宿主基因的编辑，从而研究基因的生物学功能。方法本研究通过前期全基因筛选得到的宿主因子并运用CRISPR/Cas9技术针对构建跨膜蛋白240(Transmembrane protein 240, TMEM240)的外显子胞内环区域进行敲除，通过Western blot验证TMEM240蛋白完全敲除后得到单克隆敲除的人横纹肌肉瘤（Human rhabdomyosarcoma, RD）细胞，并探究TMEM240敲除后对E30复制的影响。结果 TMEM240的敲除能够显著抑制E30早期阶段的复制，但并不影响结合和内化阶段的复制。免疫荧光染色显示，TMEM240敲除后E30 dsRNA与早期核内体标志物Rab5A共定位显著减少，提示其参与E30早期核内体复制；转录组学分析表明，TMEM240相关差异基因富集于自噬体成熟、自噬体-溶酶体融合等通路。随后通过mCherry-GFP-LC3B融合腺病毒感染细胞试验、Western blot试验、共聚焦实验、溶酶体pH检测以及转录因子EB(Transcription factor EB, TFEB)核易位试验发现TMEM240的敲除/低能够影响自噬体-溶酶体的融合从而导致自噬体的累积以及TFEB的核转移。结论 本研究的结果显示TMEM240促进E30的复制，并且在自噬体-溶酶体的融合过程中发挥作用，这一发现为进一步了解E30的感染机制奠定基础。
2024年四川省广安市HFMD病原谱及基因进化分析
刘轩;尹柳;陈毅;曲颖丽;石强强;陈泽;梅国勇;杜海军;于书海;石杭久;夏志强;宋芹芹;韩俊;目的研究2024年中国四川省广安市手足口病（Hand, foot and mouth disease, HFMD）病原谱，并分析HFMD的遗传演变，从而为该地区HFMD防控工作提供基础数据和科学依据。方法 采集2024年四川广安符合手足口病定义的病例的咽拭子样本。采用荧光定量聚合酶链式反应（Quantitative real-time polymerase chain reaction, qPCR）对这些样本进行肠道病毒（Enterovirus , EV）筛查。对EV阳性样本的核酸通过聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction, PCR）扩增其VP1基因，进行测序、分型及系统发育分析。结果 共收集HFMD病例咽拭子94例，EV阳性率76.6%(72/94)。使用肠道病毒通用分型引物，成功分型60例，其中5例Coxsackievirus A4(CVA4,5/60,8.3%),4例Coxsackievirus A5(CVA5,4/60,6.7%),24例Coxsackievirus A10(CVA10,24/60,40%),26例Coxsackievirus A16(CVA16,26/60,43.3%),1例Echovirus B25(E25,1/60,1.7%)。完整扩增VP1基因22株，其中1株为CVA4毒株（D型），1株CVA5毒株（D型），7株CVA16毒株（4株B1a,3株B1c）,13株CVA10毒株（C2型）。结论 2024年四川省广安市人民医院就诊HFMD患儿中，主要病原体为CVA16，其次为CVA10;CVA16主要流行株为B1a和B1c型，CVA10主要流行株为C2型。本研究为单中心研究，相关结果仅反映本院就诊患儿的病原学特征，尚不能完全代表广安市全市手足口病的流行特点。未来需在本地区持续开展多中心、大范围的HFMD病原监测，进一步明确当地流行株分布规律，为防控提供依据。
柯萨奇病毒A4型毒株的分离鉴定和生物学特征分析
任潇虹;廖芸;王晶晶;李恒;赵鑫;赵恒;李丹丹;于丽;邱恒;郑惠文;刘龙丁;目的 引起手足口病(Hand, foot, and mouth disease, HFMD)的肠道病毒(Enteroviruses)病原组成复杂多样，其中柯萨奇A组病毒(Coxsackievirus A group)的毒株分离鉴定和感染致病特征对于HFMD的研究和疫苗研制显得越来越重要，因此，本研究旨在阐明柯萨奇病毒A组4型(Coxsackievirus A4,CVA4)的分离鉴定过程并对其生物学特征进行分析，为后续疫苗研制提供参考。方法 通过KMB17细胞分离CVA4病毒，同时利用PCR扩增CVA4 VP1基因序列以鉴定基因型别，在电镜下观察病毒颗粒形态，利用Western Blot(WB)和银染实验分析主要结构蛋白。在KMB17细胞上系统探究CVA4增殖动力学以及乳鼠体内的感染特征，最后结合中和抗体实验和ELISpot实验对CVA4病毒免疫原性进行分析。结果 本研究从手足口病患儿粪便样本中分离获得3株CVA4毒株，接种人二倍体细胞KMB17后，可观察到皱缩、变圆和肿胀等致细胞病变(Cytopathic effect, CPE)特征，主要结构蛋白基因VP1测序鉴定毒株均属CVA4病毒D2基因亚型。经KMB17细胞扩增培养，随后分析发现，透射电子显微镜下可观察到CVA4病毒呈现典型的二十面体的颗粒形状，以实心颗粒为主，病毒颗粒直径约为30nm。经WB和银染实验分析发现，扩增病毒纯化液中可见VP1、VP3的完整结构蛋白条带，并为特异性抗-CVA4血清所识别。以KMB17细胞为基质进行噬斑克隆纯化，我们筛选获得E-4、E-2和B-2克隆株，增殖动力学特征显示三株病毒均能够在MOI=0.05条件下实现较快增殖，并在96h以内达到增殖高峰，感染性滴度分别为107.5 CCID50/mL、105.75 CCID50/mL、107.75 CCID50/mL。通过颅内注射2000 CCID50/只病毒的方式感染2日龄乳鼠后，3株CVA4病毒株均能引起乳鼠麻痹症状，并在感染后3～5d全部死亡。初步免疫原分析结果提示，上述3株毒株经腹腔注射BALB/c小鼠，能诱导较好的体液免疫和细胞免疫应答，两次免疫后中和抗体几何平均滴度分别达到2622.2、1456.1、5045.1。结论 结合病毒增殖特征和免疫原性，本研究提示E-4和B-2在增殖特性和免疫原性方面的表现相对优于E-2，未来研究中可进一步探索其作为潜在疫苗候选株的可能性。
[下载次数： 64 ] [被引频次： 0 ] [阅读次数： 64 ] HTML PDF 引用本文
肠道病毒A组71型灭活疫苗免疫效果及其持久性评估
王建醒;张晓丽;刘晓林;董祯;孙文魁;寇增强;目的 调查山东省临沂市适龄儿童接种肠道病毒A组71型(Enterovirus A71,EV-A71)灭活疫苗后，血清中EV-A71中和抗体阳性率、抗体几何平均滴度(GMT)和抗体持续时间，了解EV-A71灭活疫苗的实际免疫保护效果，为山东省精准防控手足口病提供EV-A71疫苗免疫效果的数据支持。方法 采用分层随机抽样方法，于2020年在山东省临沂市8个区(县)选取7岁以内已接种2剂次EV-A71灭活疫苗的195名儿童，作为疫苗接种组的研究对象；同时选取195名未接种过疫苗且无手足口病发病史的儿童，作为对照组研究对象。收集研究对象的姓名、性别、年龄、疫苗接种时间、手足口病发病史等信息，由家长填写《儿童家长EV-A71疫苗认知和接种意愿调查问卷》，并签署知情同意书。采集血标本后，分离血清，通过经典细胞微量中和试验方法测定血清中EV-A71中和抗体滴度，计算抗体阳性率和几何平均滴度(Geometric mean titer, GMT)，不同组间EV-A71血清中和抗体总阳性率的比较用卡方检验，GMT的比较则使用配对样本t检验和单因素方差分析。结果 接种组和对照组EV-A71血清中和抗体总阳性率分别为95.90%和62.56%；中和抗体GMT分别为60.46(95%CI:49.24～74.24)和9.49(95%CI8.40～10.71)。疫苗接种组的EV-A71血清中和抗体总阳性率显著高于对照组(χ2=65.83,P<0.0001)，且疫苗接种组的GMT也显著高于对照组(t=7.032,P<0.001)。性别和初次接种疫苗的月龄对EV-A71血清中和抗体阳性率和GMT均无影响。随着接种时间的推移，EV-A71血清中和抗体GMT水平呈现逐年下降的趋势，其GMT水平从半年内的174.9(95%CI:101.7～300.5)，在两年半后下降至48.03(95%CI:34.82～66.23)，尤其是在接种2.5年后，GMT水平下降趋势尤为明显。尽管如此，接种疫苗2.5年后的GMT水平48.03(95%CI:34.82～66.23)仍远高于对照组GMT水平9.49,(95%CI:8.40～10.71)(P<0.001)，说明接种两剂次EV-A71灭活疫苗在两年半内仍然具有良好的保护效果。结论 EV-A71灭活疫苗在适龄儿童免疫中，表现出较高的阳性率和GMT水平，具有良好的免疫保护效果。然而，为了维持较高的抗体滴度水平，建议在初次接种后的两至三年进行加强免疫，以持续保障疫苗的防护效力。
金振口服液对人冠状病毒HCoV‑229E和细菌感染致小鼠肺炎模型的药效学作用研究
冯奕瑄;孙静;包蕾;耿子涵;王馨蔚;李舒冉;张敬升;谢丹;郭姗姗;崔晓兰;赵荣华;目的 观察金振口服液（Jinzhen oral liquid, JZOL）对人冠状病毒（Human coronavirus 229E, HCoV-229E）和金黄色葡萄球菌合并肺炎链球菌混合感染致小鼠肺炎模型的治疗作用，为JZOL的临床应用提供实验依据。方法 采用HCoV-229E滴鼻感染造成小鼠肺炎模型，观察JZOL高、中、低不同剂量组[30、15和7.5 mL/（kg·d），相当于生药8、4和2 g/（kg·d）]，对小鼠肺指数、肺组织病理学变化和肺组织病毒载量的影响，并设西药磷酸氯喹糖衣片（Chloroquine phosphate sugar-coated tablets, CQ）和中成药连花清瘟颗粒（Lianhua qingwen granules, LHQW）作为阳性对照药。采用金黄色葡萄球菌合并肺炎链球菌滴鼻感染造成小鼠肺炎模型，观察JZOL高、中、低不同剂量组对小鼠肺指数的影响，并设西药阿莫西林胶囊（Amoxicillin capsules, AMX）和中成药小儿热速清口服液（Xiao’er resuqing oral liquid, XRSQ）作为阳性对照药。结果 JZOL3个剂量组均可不同程度的降低HCoV-229E和金黄色葡萄球菌合并肺炎链球菌混合感染小鼠的肺指数，显著降低HCoV-229E感染小鼠肺组织病毒载量并明显改善HCoV-229E病毒感染小鼠肺组织的病理损伤。结论 JZOL对HCoV-229E和金黄色葡萄球菌合并肺炎链球菌混合感染小鼠肺炎模型具有较好的治疗作用。
15种中药体外抗PRRSV‑2的作用研究
熊倩;陆小玉;梁康丽;王鹏程;刘冰洁;米雪董;温贵兰;目的 针对猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respirator syndrome virus, PRRSV)变异快、易与疫苗株重组且现有疫苗防控效果不理想等问题，通过体外试验筛选具有抗PRRSV活性的中药，并初步探究其抗病毒作用机制，以期为中药抗PRRSV研究奠定基础。方法 选取15种清热解毒类中药，采用体外细胞模型，通过CCK8法测定各中药在Marc-145和PAM-CD163细胞中的最大安全浓度，结合细胞病变观察、TCID50、RT-qPCR、Western blot及间接免疫荧光技术，综合评价中药抗病毒效果。对效果显著的中药进一步运用网络药理学和分子对接技术分析其抗PRRSV的活性成分、作用靶点及潜在机制。结果 综合两种细胞模型，共筛选出木芙蓉叶、卷柏、肿节风、野菊花、银杏叶和贯众这6种共同有效的中药。选取抑制效果最佳的肿节风进行深入分析，网络药理学结果显示，其主要活性成分为槲皮素，可作用于IL-6、IL-1β、IL-10、IFN-γ、TGF-β1、CASP3和CCL2等关键靶点。这些靶点显著富集于IL-17信号通路及细胞因子-细胞因子受体相互作用等免疫炎症相关通路，主要参与慢性炎症反应、免疫应答调控及细胞分化等生物学过程。分子对接结果表明槲皮素与核心靶点具有较强的结合能力。结论 本研究成功筛选出6种具有抗PRRSV活性的中药，其中肿节风抑制效果最佳，其活性成分槲皮素通过多靶点、多通路的协同作用调控宿主免疫与炎症反应，从而有效抑制病毒复制，为中药抗PPRSV研究提供了重要理论依据。
桂林地区2023‑2024年B型流感病毒的HA和NA基因特征分析
曹锦;蔡茹;田文妍;饶朵;宋芹芹;杜海军;梅国勇;夏志强;韩俊;目的 分析2023–2024流行季桂林地区B型流感病毒（Influenza B virus, IBV）的血凝素（Hemagglutinin,HA）和神经氨酸酶（Neuraminidase, NA）分子进化特征。方法 对400例流感样病例进行核酸检测，扩增IBV阳性样的HA与NA基因并测序，使用MEGA、DNAStar等软件，构建系统发育树，对抗原变异位点、耐药突变及糖基化位点进行分析。结果 2023年10月-2024年10月，桂林地区IBV主要在2023年冬及2024年春季流行，在400份流感样病例中检出率为18%。基因扩增获得26株桂林IBV的HA和NA序列。系统发育分析显示，26株桂林IBV均属1A.3a.2分支（C.5.7亚分支），与当前疫苗株同源性较高。在HA蛋白的发现15处变异，其中位于主要抗原决定簇5处：E128G(120环)、R141G(150环)、D197E(190螺旋)、198(190螺旋)和199(190螺旋)。NA蛋白未发现与耐药基因相关的变异，未发现糖基化位点的增减。结论 本流行季桂林地区B型流感病毒HA蛋白关键抗原表位已发生少量变异，NA蛋白则相对保守。流行株虽与疫苗株同源性较高，但抗原位点的变异提示存在抗原漂移的潜在风险。应持续加强对B型流感病毒的分子监测，以早期预警抗原漂移、指导流感精准防控。
人乳头瘤病毒16型C3亚系L1蛋白对假病毒感染力及疫苗中和能力的影响研究
于东渤;卢学新;李颖;王慧;张杰琼;王明明;张莉;朱娜;王娇;王世文;目的 本研究旨在探索人乳头瘤病毒16型C3亚系（Human papillomavirus type 16,HPV16）主要衣壳蛋白L1对假病毒感染力及疫苗中和能力的影响。方法 通过NCBI数据库获取HPV16的16种亚系的L1蛋白序列，利用293FT细胞制备假病毒，研究C3亚系L1对上皮细胞感染能力及对希瑞适、佳达修和佳达修-9(Cervarix、Gardasil和Gardasil-9)三种疫苗敏感性之间的差异。结果 多序列比对表明C3亚系与参考蛋白（WT,P03101）相比有8个氨基酸突变位点（占比1.6%），是所有亚系中突变位点最多的。C3亚系与WT在假病毒形态、组装效率及对293FT细胞的感染能力上均无显著差异（P > 0.05）。假病毒中和试验结果显示，三种疫苗对C3亚系的中和效价较WT均显著下降。Cervarix、Gardasil和Gardasil-9对C3的中和能力分别为WT的40%、46%和50%。结论 本研究成功鉴定对当前疫苗敏感性显著性降低的C3亚系L1。它对上皮细胞感染能力不变，但是对疫苗敏感性显著降低，提示我们应该加强对不同HPV16亚系或变异体的监测，同时也为新疫苗研发提供数据支持。
痘苗病毒天坛株N1L基因在病毒扩散与致病中的作用研究
陈思研;翟玉倩;韩一泽;吴长城;赵莉;任皎;田厚文;叶飞;王文玲;谭文杰;目的 痘苗病毒N1L基因在抑制宿主凋亡与天然免疫中发挥关键作用，但其在痘苗病毒天坛株(Vaccinia virus Tiantan strain, VTT)中的具体功能尚未明确。本研究旨在阐明N1L缺失对VTT复制、扩散及体内致病性的影响。方法 利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建N1L缺失的重组病毒VTT-ΔN1L。通过细胞模型(HeLa、Vero、BHK-21)分析病毒复制动力学与噬斑形成能力；采用BALB/c小鼠滴鼻感染模型，以不同剂量(106 PFU、107 PFU)评价病毒毒力，监测体重变化与存活率。结果 在HeLa、Vero和BHK-21细胞中，VTT-ΔN1L的复制效率与野生型VTT无显著差异(P > 0.05)，但其形成的噬斑面积在感染后期(48 h)显著减小(P<0.0001)，表明病毒细胞间扩散能力受限。动物实验显示，VTT-ΔN1L感染组小鼠体重下降幅度显著低于VTT组(107 PFU组峰值下降16%vs 25%)，存活率提高(100%vs 83%)，但体重最低点出现时间较VTT组提前2-3d。结论 N1L缺失虽不影响VTT在细胞中的复制，但通过限制病毒扩散和解除其免疫抑制功能，显著降低病毒在小鼠体内的毒力，同时可能引起宿主早期免疫反应增强。该研究揭示了N1L在VTT致病过程中的关键调控作用，为基于VTT的减毒疫苗设计与抗正痘病毒策略提供了理论依据。
促病毒宿主因子COPI成员COPB2调控痘苗病毒生命周期的体外实验研究
李兆卿;霍恕婷;李若瑞;张越;王亚伟;刘士元;韩一泽;林志峰;王文玲;赵莉;黄保英;邓瑶;吴长城;谭文杰;目的 探讨宿主因子衣被蛋白复合物亚基β2(Coatomer subunit beta 2, COPB2)在痘苗病毒（Vaccinia virus,VACV）复制过程中的作用及其作为广谱抗正痘病毒药物靶点的潜力。方法 整合分析现有高通量宿主因子筛选研究，挖掘高频出现的促病毒宿主因子，选定COPB2为研究对象，以已知宿主因子整合素亚基β1(Integrin subunit beta 1, ITGB1)为阳性对照。在HeLa和HEK-293T细胞中构建siRNA介导的基因敲低模型，通过CCK-8法评估细胞活性，利用噬斑形成实验检测子代病毒滴度，使用qPCR检测病毒基因组复制载量，并通过Western blot检测病毒早期与晚期蛋白表达水平。结果 成功构建基于siRNA的COPB2与ITGB1基因敲低模型。与对照组相比，敲低COPB2或ITGB1均可显著抑制VACV复制，表现为子代病毒滴度明显降低，病毒基因组复制载量下降以及病毒早期及晚期蛋白表达减少。结论 COPB2是促进VACV高效复制的重要宿主因子，初步推测其功能可能主要参与病毒生命周期的中晚期阶段，但其具体作用环节及分子机制仍有待进一步系统阐明。本研究提示，COPB2具有成为天花、猴痘等正痘病毒广谱宿主靶向抗病毒干预靶点的潜在价值。