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2024年 03期

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呼吸道病毒研究专题论著

衔接蛋白复合物1γ1亚基影响SARS-CoV-2感染性的分析

纪月;邱曼曼;谈娟;乔文涛;

新型冠状病毒(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2)引发了全球大流行的新型冠状病毒感染(Coronavirus disease 2019, COVID-19),对人类健康和社会经济发展造成极大威胁,深入研究其感染复制机制对防控该病毒致病及流行至关重要。有研究发现SARS-CoV-2可通过网格蛋白介导的内吞、转运系统进入细胞建立感染。衔接蛋白复合物1 γ1亚基(Adaptor related protein complex 1 subunit gamma 1, AP1G1)是衔接蛋白复合物1(Adapter protein 1, AP-1)的重要组成部分,参与胞吞、囊泡转运等生理过程。本文基于相关文献报道选择AP1G1展开研究,确证其对SARS-CoV-2感染性的影响并初探机制。首先借鉴文献,建立了SARS-CoV-2病毒样颗粒(SARS-CoV-2 virus like particles, SC2-VLPs)系统作为报告病毒,发现过表达AP1G1降低以携带萤火虫荧光素酶为报告基因的SC2-VLPs-Luc的感染性;敲减内源AP1G1增强SC2-VLPs-Luc的感染性;发现AP1G1可被包装入SC2-VLPs-Luc,虽未改变SC2-VLPs-Luc中病毒结构蛋白组成,但影响SC2-VLPs-Luc递送mRNA能力。本研究为解析AP1G1功能及其对SARS-CoV-2感染性的影响提供了新的实验证据。

2024 年 03 期 v.40 ; 国家重点研发计划项目(项目号:2018YFE0107600),题目:靶向活化胞内固有免疫在病毒性传染病防控中的应用~~
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广谱抗病毒药物吐根碱抑制HCoV-OC43的转录组分析

李涵;张高倩;吴长城;张钟贤;牛军伟;霍恕婷;叶飞;邓瑶;黄保英;赵莉;沈晓玲;谭文杰;

本研究旨在探索吐根碱对人冠状病毒OC43(Human coronavirus OC43, HCoV-OC43)的作用时相和抗病毒机制。首先,在MRC-5细胞上建立了HCoV-OC43病毒的体外感染复制动力学曲线,测定了药物的EC50和CC50。结果表明吐根碱能够在感染早期有效地抑制HCoV-OC43病毒在MRC-5细胞中的复制。通过转录组分析,发现HCoV-OC43感染和吐根碱处理均导致宿主基因表达的紊乱,并且两者共同激活了抗病毒通路。吐根碱可能通过激活OASL、Mx1和IFIT2等抗病毒基因来增强宿主对病毒的抵抗能力。此外,吐根碱还可能通过抑制TMEM41B表达而进一步影响病毒复制过程。这些研究结果为深入探究吐根碱作为抗冠状病毒药物的机制和潜在靶点提供了重要线索。

2024 年 03 期 v.40 ; 国家重点研发计划(项目号:2023YFC3041500),题目:奥密克戎变异规律分析与防控研究;国家重点研发计划(项目号:2021YFA1201003),题目:抗病毒纳米药物的体内外功能评价;; 国家自然科学基金(项目号:U21A20384),题目:基于PROTAC技术靶向降解SARS-CoV-2 Mpro蛋白的新型广谱抗冠状病毒药物的研发~~
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微小RNA-93-5p调控Toll样受体4基因抑制呼吸道合胞病毒感染支气管上皮细胞炎症反应的机制研究

刘淑娇;张勇刚;赵晓燕;

研究miR-93-5p调控TLR4基因抑制呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial sirus, RSV)感染支气管上皮细胞炎症反应。培养人支气管上皮细胞16-HBE,RSV感染,实验分为RSV+miR-NC组、RSV+miR-93-5p组、RSV+si-NC组、RSV+si-TLR4组、RSV+pcDNA-NC组、RSV+pcDNA-TLR4组、RSV+miR-93-5p+pcDNA-NC组、RSV+miR-93-5p+pcDNA-TLR4组。qRT-PCR评估miR-93-5p、TLR4 mRNA表达水平;酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测TNF-α、IL-1β、IL-6水平;细胞计数试剂盒(CCK-8)法检测细胞增殖;Western blot检测CyclinD1、P21蛋白表达;双荧光素酶报告实验验证miR-93-5p对TLR4的靶向调控。与Con组比较,RSV组miR-93-5p表达水平显著降低,TLR4 mRNA表达水平显著增加(P<0.05)。与RSV+miR-NC组比较,RSV+miR-93-5p组16-HBE细胞中miR-93-5p表达水平显著增加,TNF-α、IL-1β、IL-6水平显著降低,细胞存活率、CyclinD1蛋白表达显著增加,P21蛋白表达显著降低(P<0.05)。与RSV+si-NC组比较,RSV+si-TLR4组16-HBE细胞中TLR4 mRNA表达水平显著降低,TNF-α、IL-1β、IL-6水平降低,细胞存活率、CyclinD1蛋白增加,P21蛋白减少(P<0.05)。与RSV+miR-93-5p+pcDNA-NC组比较,RSV+miR-93-5p+pcDNA-TLR4组16-HBE细胞中TLR4 mRNA表达水平显著增加,TNF-α、IL-1β、IL-6水平显著增加,细胞存活率、CyclinD1蛋白表达显著降低,P21蛋白表达显著增加(P<0.05)。miR-93-5p负调控TLR4基因抑制呼吸道合胞病毒感染支气管上皮细胞炎症反应。

2024 年 03 期 v.40 ;
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穿心莲内酯调控p38及ERK磷酸化改善甲型流感病毒诱导肺上皮细胞损伤的作用

李刚;田甜;王磊;徐淑娜;杨文平;

甲型流感病毒(Influenza A virus,IAV)感染引起肺上皮细胞损伤与促进p38磷酸化、抑制细胞外调节蛋白激酶(Extracellular regulated protein kinases,ERK)磷酸化有关,穿心莲内酯(Andrographolide,AD)通过抗凋亡、抗炎、抗氧化等途径发挥细胞保护作用且对促分裂素原活化蛋白激酶38(Protein 38,p38)、ERK的磷酸化具有调控作用。为研究AD通过调控p38及ERK磷酸化改善IAV诱导肺上皮细胞损伤的作用,本文培养小鼠肺上皮细胞株MLE-12,按照MOI=0.2感染IAV 2h后给予不同剂量(6.25、12.5、25.0 mg/L)AD或25.0 mg/L AD联合对照溶剂(体积分数0.1%)、p38激动剂SB202190(10μmol/L)、ERK抑制剂PD98059(20μmol/L)处理10h,检测细胞的增殖抑制率、凋亡率,培养基中白介素(Interleukin,IL)-1β、肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、IL-6、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、总抗氧化力(Total antioxidant capacity,T-AOC)的含量,细胞中p-p38、p-ERK的表达水平。结果显示:感染IAV的MLE-12细胞中SOD、T-AOC含量、pERK表达水平降低,增殖抑制率、凋亡率、IL-1β、TNF-α、IL-6、MDA含量及p-p38表达水平增加(P<0.05);不同剂量AD组MLE-12细胞中SOD、T-AOC含量、p-ERK表达水平增加,增殖抑制率、凋亡率、IL-1β、TNF-α、IL-6、MDA含量及p-p38表达水平降低(P<0.05);SB202190+AD组、PD98059+AD组MLE-12细胞中SOD、T-AOC含量降低,增殖抑制率、凋亡率、IL-1β、TNF-α、IL-6、MDA含量增加(P<0.05)。以上结果表明,AD通过抑制p38磷酸化、促进ERK磷酸化的方式抑制细胞凋亡、炎症反应及氧化应激反应,进而减轻IAV诱导肺上皮细胞损伤。

2024 年 03 期 v.40 ;
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痘病毒研究专题论著

痘苗病毒天坛株N1L基因表达调控序列的克隆与特性分析

翟玉倩;韩一泽;吴长城;张钟贤;赵莉;罗美惠;豆亚美;刘士元;任皎;田厚文;王文玲;谭文杰;

本研究以痘苗病毒天坛株(Vaccinia Virus Tian Tan Strain,VTT)为对象,旨在明确N1L基因的表达调控序列。我们克隆了N1L起始密码子ATG上游不同长度的调控序列片段,构建了表达载体,并利用报告基因萤火虫荧光素酶(Firefly luciferase,Fluc)的表达来确定N1L表达调控序列区域。通过PROMO在线预测网站,预测了与调控序列结合的转录因子。结果显示,VTT中N1L基因的表达受到上游调控序列的调控,其中以-404bp起始的片段启动的Fluc表达量最高。PROMO预测表明该区域存在多个转录因子结合位点。本研究为痘苗病毒基因表达特点的研究提供了实验依据,并为N1L基因功能及机制研究奠定了基础。

2024 年 03 期 v.40 ;
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检测痘苗病毒体外感染的病灶形成方法的优化与应用

楚巧鸿;冯霞;李佳;张菱芳;单徐畅;舒畅;程雪婷;霍恕婷;邓瑶;谭文杰;

本研究旨在建立一种快速、通用、高通量的病灶形成测定法(Focus-forming assay, FFA),用于痘苗病毒(Vaccinia virus, VACV)的研究。首先采用经典噬斑染色法与免疫噬斑法对不同VACV代表性毒株(Western Reserve strain, WR; Tiantan strain, VTT; Modified Ankara strain, MVA)在BHK-21细胞和Vero细胞上的噬斑特性进行评估,通过实验条件(包括显色液、非特异性染色、细胞培养板和病毒培养时间)的优化,提高病灶的可视化质量和测定的准确性。并基于改进优化的FFA法研究了VACV在BHK-21细胞和Vero细胞上的生长曲线,同时对FFA法的重复性进行了评估。研究发现BHK-21细胞对VACV的感染更加敏感,适宜于多种VACV滴度测定。实验条件的优化显著提高了病灶的可视化质量和测定的准确性。应用FFA法发现WR、VTT和MVA毒株在BHK-21细胞上能够有效复制,而MVA在Vero细胞上的复制受限,且FFA法在同一实验内具有良好的重复性,变异系数在0.17%到3.50%之间。改进后的FFA法是一种快速、通用、高通量的方法,适用于痘苗病毒滴度的测定,为痘苗病毒的研究和应用提供了可靠的技术支持。

2024 年 03 期 v.40 ; 国家重点研发计划(项目号:2023YFD1800405),题目:抗猴痘药物筛选与阻断技术研究;国家重点研发计划(项目号:2022YFC2303401),题目:潜在高危新病毒风险识别的新技术体系研究~~
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人类病毒研究论著

表达gH/gL抗原的腺病毒载体EBV疫苗免疫BALB/c小鼠后的T细胞表位鉴定

石雪洋;郝彦哲;李晨雨;马琦;王冰丹;冯霞;李淑英;

为了鉴定表达爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barr virus,EBV)gH/gL保护性抗原的腺病毒载体疫苗在BALB/c小鼠中的T细胞表位,本研究使用表达gH/gL蛋白的腺病毒载体EBV疫苗免疫BALB/c小鼠,利用IEDB Analysis Resource软件对序列进行亲和力预测,设计合成EBV gH基因和gL基因的肽库,并将其混合成肽池,取免疫后的小鼠脾细胞进行IFN-γ ELISPOT检测,通过肽池和单肽两轮筛选检测具有阳性反应的多肽片段,确定优势反应肽。结果显示筛选出gH基因5条特异性优势肽,其中序列为LRGPFSYPSLTSAQS的单肽反应最强;gL基因4条特异性优势肽,其中序列为ASLNSPKNGSNQLVI的单肽反应最强。本研究使用IFN-γ ELISPOT法筛选和确定了9条EBV gH抗原特异性和gL抗原特异性优势T细胞表位,为EBV免疫学与疫苗研究提供了参考。

2024 年 03 期 v.40 ; 艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治科技重大专项(项目号:2018ZX10731101-002-010),题目:MVA及Ad5载体疫苗联合应用的临床前研究;; 河北省自然基金生物医药联合基金培育项目(项目号:H2022209049),题目:HPV E6E7融合基因重组病毒的构建及其抗肿瘤机制研究~~
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中国HIV-1临床分离株感染性假病毒的构建及其中和特征分析

冯家敏;郭慧敏;刘聪聪;程林;汪海燕;孙丽琴;鞠斌;张政;

本研究从中国人类免疫缺陷病毒1型(Human immunodeficiency virus-1, HIV-1)感染者血浆样本中分离和构建HIV-1 Envelope(Env)感染性假病毒,并分析其对单克隆广谱中和抗体的敏感性。采用逆转录和巢式PCR方法从感染者样本中扩增HIV-1 env基因,利用同源重组方法将env基因克隆至真核表达载体pVAX1中,包装HIV-1Env假病毒后使用TZM-bl/假病毒中和实验方法检测单克隆广谱中和抗体的中和能力,基于已有抗体的结构数据分析病毒逃逸中和抗体的关键突变位点。本研究从两个HIV-1感染者donor A和donor B中分别获得了8株和3株携带CRF07_BC亚型env基因的感染性假病毒;序列分析显示两组假病毒Env氨基酸同源性仅为83.2%~85.2%,存在一定的差异;11株假病毒对于VRC01和10E8中和抗体依旧敏感,而对于35O22和VRC34.01耐受;donor B来源的假病毒存在N133D和R170E突变而可能影响了PG16抗体的中和能力,donor A来源的假病毒可能由于携带了S291F和E336K突变而逃逸了VRC-PG05抗体,donorA来源的假病毒还可能通过G324E突变进一步影响PGT121中和抗体的活性。本研究成功获得了11株中国HIV-1 CRF07_BC亚型的Env假病毒,评估了临床分离株病毒对已有中和抗体的敏感性,揭示了病毒逃逸中和抗体的关键突变位点,为中国HIV-1感染者应用单克隆中和抗体治疗提供了选择依据,同时也丰富了HIV-1假病毒与中和抗体领域的研究。

2024 年 03 期 v.40 ; 深圳市科技计划项目(项目号:JCYJ20190809115617365),题目:HIV-1单克隆广谱中和抗体的分离鉴定及其中和机制研究~~
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利用CRISPR/Cas9技术建立STAT1敲除细胞系及其功能验证

张俊梅;王芳;应旗康;冯文杰;古天乐;吴兴安;

信号转导和转录活化因子1(Signal transducer and activator of transcription 1,STAT1)是干扰素信号通路中的关键分子,在对抗病毒和其他病原体的免疫反应中发挥重要作用,构建STAT1敲除细胞系有助于研究其在病毒感染过程中的作用与机制。本研究利用CRISPR/Cas9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats-Cas9)基因编辑技术构建STAT1基因敲除细胞系。首先构建STAT1基因特异性打靶载体,后通过慢病毒转导人非小细胞肺癌细胞系(Human non-small cell lung cancer cells,A549),嘌呤霉素筛选稳定转导的细胞后进行单克隆化,最后对获取的单克隆细胞在分子水平上进行敲除及敲除回补验证,成功构建一株STAT1基因敲除(STAT1 gene knockout,STAT1-KO)的A549细胞,且该细胞系可维持正常细胞活性与增殖能力。以汉滩病毒(Hantaan virus,HTNV)感染验证,发现在该细胞系中病毒复制水平明显升高。本研究成功构建了一株STAT1-KO A549细胞,可为抗病毒药物和干扰素信号通路研究提供有力工具。

2024 年 03 期 v.40 ; 国家自然科学基金面上项目(项目号:81971563),题目:基于汉滩和汉城病毒包膜糖蛋白保守区域设计的肾综合征出血热通用亚单位疫苗的研究;国家自然科学基金面上项目(项目号:82272330),题目:NLRC3-mTORC1轴介导的T细胞代谢重编程在HFRS急性肾损伤中的作用与机制研究;; 青年科学基金(项目号:82302525),题目:GSK3β通过磷酸化降解NP抑制汉滩病毒感染的作用和机制研究~~
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2020-2022年济南市污水中札如病毒的型别构成及其分子特征

龙森;纪峰;林小娟;刘尧;陶泽新;徐爱强;

札如病毒(Sapovirus, SaV)具有高度的遗传多样,是引起散发或暴发病毒性胃肠炎的重要病原体之一。为了解中国东部地区人类SaV的流行情况及其基因型多样性,本研究于2020年1月至2022年12月,在山东省济南市采集并处理了36份污水样本,实时荧光定量RT-PCR检测显示33份(91.67%)污水样本为阳性;使用巢式RT-PCR对部分VP1序列进行扩增,电泳显示16份样本为阳性(44.4%);对扩增产物分别进行下一代测序(Next generation sequencing, NGS)和分析,共鉴定出7种SaV基因型,属于GI、GII和GV三个基因群,包括5种主要基因型(GI.1、GI.2、GI.6、GII.1和GV.1)和2种不常见的基因型(GII.3和GII.5);研究期间内,优势基因型在2021年4月前后由GI.2型转换为GI.1型。基于部分VP1序列的系统发生学分析显示本地序列和外来序列在某些分支中聚集,具有密切的亲缘关系。本研究丰富了新冠疫情以来三年内札如病毒的分子流行病学特征,证明了基于NGS的环境污水监测可以增加人们对SaV流行状况的认识,对深入研究我国SaV的分布及流行具有重大意义。

2024 年 03 期 v.40 ; 泰山学者青年专家计划项目(项目号:tsqn202103187),题目:基于同一健康理念和下一代测序技术新型病毒的发现、溯源和进化动态研究;; 国家自然科学基金面上项目(项目号:81573209),题目:环境污水中人类胃肠炎病毒的型别多样性、遗传进化规律及其与人群疾病发生的关系~~
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