2024年 05期
SARS-CoV-2亚单位疫苗制备及免疫原性初步研究
徐骁;黄涛;刘铁柱;芜为;孙丽娜;李川;李建东;王世文;王希良;严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2(Severe acute respiratory symptom coronavirus 2,SARS-CoV-2)自2019年年末出现以来，给全人类造成了严重的公共卫生事件和社会经济负担。本实验以SARS-CoV-2突变株XBB1.5的受体结合域（Receptor binding domain,RBD）序列为疫苗核心分子串联SARS-CoV-2的全长S蛋白制备了亚单位纳米颗粒疫苗。将S蛋白的6个氨基酸残基突变为6个脯氨酸残基，提高表达量和蛋白质分子的稳定性。而且将弗林酶酶切位点进行突变以增加蛋白质的稳定性。在羧基端串联昆虫铁蛋白的氨基酸序列，利用铁蛋白纳米颗粒多面体可结合抗原蛋白的特性，增加抗原递呈。在氢氧化铝和CpG1018双佐剂组合免疫小鼠后，可诱导小鼠产生针对SARS-CoV-2多种变异株的中和抗体，且可诱导小鼠产生了较强的细胞免疫和体液免疫。本研究表明，XBB1.5突变株RBD区域串联S蛋白全长序列及昆虫铁蛋白制备的纳米颗粒疫苗可以有效预防SARS-CoV-2变体，是一个很好的候选疫苗分子。
基于LLR载体表达SARS-CoV-2 RBD蛋白rLLR/NSP3-CoV-2/RBD重组病毒的拯救及鉴定
刘夏飞;任伟宏;李杉;余俊杰;朱武洋;段招军;2019年12月以来，严重急性呼吸综合征冠状病毒2(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARSCoV-2)席卷全球，但在控制SARS-CoV-2大流行的综合策略中一直空缺3岁以下儿童的免疫接种。兰州羔羊株轮状病毒（Lanzhou lamb rotavirus,LLR）是我国获批上市用于预防婴幼儿轮状病毒胃肠炎的常规减毒活疫苗，本研究利用反向遗传学技术将SARS-CoV-2的受体结合结构域（Receptor-binding domain,RBD）蛋白插入LLR/NSP3基因的ORF后进行重组病毒拯救，通过结合致细胞病变效应（cytopathic effect, CPE）、dsRNA PAGE硝酸银染色和NSP3基因RT-PCR扩增证明我们成功拯救出rLLR/NSP3-CoV-2/RBD重组病毒，且重组病毒的NSP3基因在P5代以内出现了与预期相符的条带迁移。本研究进一步通过Western blot和间接免疫荧光证明rLLR/NSP3-CoV-2/RBD重组病毒可以在P5代以内稳定表达SARS-CoV-2 RBD蛋白。间接免疫荧光和qRT-PCR扩增的结果显示虽然rLLR/NSP3-CoV-2/RBD的滴度和在不同时间点的基因组拷贝数略低于亲本株rLLR，但不影响病毒的感染和复制。本研究通过反向遗传学技术成功拯救出能在P5代以内稳定表达SARS-CoV-2 RBD蛋白的rLLR/NSP3-CoV-2/RBD重组病毒，为进一步探索开发适合3岁以下儿童使用的口服轮状病毒和SARS-CoV-2联合疫苗提供了思路。
新冠病毒非选择性突变增加相关的非结构蛋白突变探究
边紫薇;刘蕊艳;欧阳灏童;马李恩;胡贵方;王海鹰;严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（新冠病毒，Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2）基因组不断发生变异，新冠病毒非结构蛋白可影响新冠病毒基因组复制和组装。研究发现，通常认为比较保守的非结构蛋白也存在不同程度的变异。本研究旨在找出可能与新冠病毒非选择性突变增加相关的热点非结构蛋白基因突变。从全球共享流感数据倡议组织（Global Initiative of Sharing All Influenza Data, GISAID）数据库下载新冠病毒序列，将得到的序列与参考序列进行比对得到各序列突变情况。采用逻辑回归检验方法筛选出与病毒非选择性突变增加相关的非结构蛋白，分析这些非结构蛋白中突变频率前五位的核苷酸突变与病毒非选择性突变的关系，找出与非选择性突变频率增加有关的热点核苷酸突变。本研究共纳入236 235条序列进行分析，各序列突变数量平均值为39.11。选取选择压力较小的M蛋白和E蛋白（Membrane protein or envelope protein, MoE）的突变总和代表病毒非选择性突变。调整发病时间、地理位置及变异株等因素后，多因素逻辑回归显示，NSP1中T670G、T445C、C745T,NSP3中C3037T、C7124T、C6402T,NSP4中C8986T、G9053T、C9891T,NSP6中T11418C、C11514T,NSP7中C11956T、C12008T,NSP12中C14408T,NSP13中C16466T、A17615G,NSP14中C19220T、A18163G、C18744T、C18877T、C19524T与MoE突变呈正相关（P<0.05），与病毒非选择性突变增加有关。新冠病毒非结构蛋白NSP1、NSP3、NSP4、NSP6、NSP7、NSP8、NSP12、NSP13、NSP14的某些热点核苷酸突变可能与基因组非选择突变增加有关。
猴痘病毒A29L-A35R-M1R融合蛋白的原核表达、纯化及免疫原性初步分析
张晓凤;高志峰;王紫研;夏伯阳;马鸣潇;费东亮;猴痘病毒（Monkeypox virus,MPXV）是一种能够感染人和动物的痘病毒，已对人类公共卫生安全构成巨大威胁，安全高效的疫苗能够有效预防和控制病毒的传播。本研究选取MPXV A29L、A35R和M1R氨基酸序列通过柔性Linker(GGGGS)连接设计融合蛋白，并根据大肠杆菌密码子偏嗜性对其密码子优化后合成全基因，插入pET-28a载体，构建pET28a-A29L-A35R-M1R重组质粒。转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞中诱导表达，经SDSPAGE和Western blot进行鉴定，并确定最佳诱导条件。在此基础上，对融合蛋白rA29L-A35R-M1R进行Ni-NTA亲和层析柱纯化后，免疫小鼠。通过ELISA方法检测抗MPXV A29L、A35R和M1R特异性IgG和细胞因子（IFN-γ、IL-2和IL-4）水平，评价融合蛋白免疫原性。实验结果显示：重组质粒pET-28a-A29L-A35R-M1R在E.coli BL21(DE3)感受态细胞中成功表达，最佳表达条件为37℃、0.25 mmol/L IPTG诱导5 h；将纯化的融合蛋白rA29LA35R-M1R免疫小鼠3次后，能够产生抗A29L、A35R和M1R特异性IgG，其中anti-rA29L-A35R-M1R IgG水平最高，且融合蛋白rA29L-A35R-M1R能够刺激机体产生高水平IFN-γ,IL-2和IL-4，与对照组差异均具有统计学意义（P<0.01）。由此表明，融合蛋白rA29L-A35R-M1R具有良好的免疫原性。为猴痘病毒新型疫苗和治疗性生物制剂的研发提供理论依据。
诺如病毒GⅡ.4 IgG抗体的荧光素酶免疫吸附方法的建立及在动物血清中的应用
王宇;张敏怡;徐嘉怡;李佳恒;梁芷妍;陈清;戴迎春;诺如病毒（Norovirus, NoV）是引起全球范围内人类急性胃肠炎（Acutegastroenteritis, AGE）的主要病原体，对全球健康和经济造成了重大威胁。已有研究在不同种类的动物粪便中检出人类诺如病毒（Human norovirus,HuNoV）的核酸或在家畜血清中检测出可识别HuNoV病毒样颗粒（Virus like particles,VLP）的抗体，这引起了公众对NoV是否为潜在人兽共患病的关注与讨论。本研究基于HuNoV主要流行株GⅡ.4建立了一种检测GⅡ.4IgG的荧光素酶免疫吸附试验（Luciferase immunosorbent assay,LISA）。LISA法具有较高的灵敏度（94.87%）和特异度（98.18%）；最低检测限是ELISA法的2～16倍；GⅡ.4-LISA检测人血清的批间和批内变异系数值均小于10%，重复性良好。GⅡ.4 IgG在狗、猪、蝙蝠、大鼠和鼩鼱等不同的家畜和野生动物中均有检出，阳性率在3.37%～39.53%之间，其中蝙蝠的检出率最高（39.53%），狗次之（9.72%）。综上所述，本研究建立的GⅡ.4-LISA方法适用于人和不同种属动物中GⅡ.4特异性IgG检测。针对HuNoV的IgG抗体广泛分布，提示NoV可能是潜在的人畜共患病。
鄂木斯克出血热病毒NS2B-NS3蛋白酶药物筛选体系的建立及抑制剂筛选
陈雅丽;封守琴;杨海涛;王泽方;肖云杰;鄂木斯克出血热病毒（Omsk hemorrhagic fever virus,OHFV）是一种蜱传黄病毒，主要分布在俄罗斯西伯利亚地区，通过蜱虫叮咬、接触感染物等途径感染人类。感染后症状包括头痛、咳嗽、发烧并伴有出血。目前尚无针对该病毒的特效药物。鄂木斯克出血热病毒基因组经翻译后形成多聚蛋白，其中NS3蛋白酶可将多聚蛋白切割从而发挥其各自在病毒复制周期中的作用。NS2B的亲水区可以作为NS3蛋白酶的辅因子维持其水解活性，在该病毒的生命周期中发挥着不可或缺的作用。该文旨在以NS2B-NS3蛋白酶为靶点开发有效抑制鄂木斯克出血热的小分子抑制剂。选用大肠杆菌表达系统表达鄂木斯克出血热病毒NS2B-NS3蛋白酶，以获得纯度高且性质均一的蛋白。同时建立药物筛选体系，开展抑制剂筛选。最终建立的药物筛选体系为20 mmol/L Tris,20%甘油，pH 8.5，蛋白终浓度为2μmol/L，底物终浓度为100μmol/L。利用该体系进行抑制剂筛选，筛选出对OHFV NS2B-NS3蛋白酶抑制率高达99%的化合物吡啶硫酮锌，并对该抑制剂进行了IC50的测定和抑制剂类型的判定，其为可逆抑制剂。吡啶硫酮锌有望成为抗鄂木斯克出血热病毒的先导化合物，为针对该病毒今后的药物开发提供研究基础。
靶向HIV-1的Cas13a/crRNA的快速筛选和抗病毒活力测定
王涛;夏学娇;马妍;高阳;周颖;董廷;涂茜;马文博;顾潮江;目前基于规律成簇的间隔短回文重复（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR）/CRISPR相关蛋白（Cas）系统的基因治疗在遗传病、肿瘤及感染性疾病等领域均取得重大突破，其中Cas13a属于VI型CRISPR系统，Cas13a蛋白在HIV感染细胞内crRNA的引导下定位目标RNA，切割核酸，同时激活Cas13a蛋白的附属效应（Collateral effect）可高效切割细胞内非特异性单链RNA，从而诱导感染细胞凋亡，进一步破坏病毒库，是最有可能功能性治愈HIV的策略。本研究旨在筛选靶向HIV-1的高灵敏度crRNA，进一步探索组合不同crRNA对HIV-1的抑制效果，并在细胞转染水平证明Cas13a/crRNA系统的附属切割活性及其诱导细胞凋亡。在LANL数据库中比对HIV-1各亚型毒株序列，获得各功能蛋白高度保守区。同时，结合HIV数据库中RNA的剪接供体及受体位点信息；然后利用MPRDOCK软件进行crRNA与LwCas13a的分子对接并计算结合复合物的自由能大小选定一组crRNA池；再以荧光标记RNA探针与LwCas13a蛋白组成可视化检测体系，以FAM荧光信号强弱确定了最有效的crRNA。构建LwCas13a和crRNA的共表达质粒，通过共转染HIV全长感染性克隆质粒和含单个或多个crRNA组合的LwCas13a的表达质粒到HEK293T细胞中，根据转染细胞及其上清再感染细胞中萤光素酶和病毒结构蛋白RNA表达水平来判定CRISPR-Cas13a系统对HIV基因表达的抑制效率。初步筛选出优选的27条crRNA并结合切割荧光强弱从中筛选出8条高灵敏度crRNA。细胞共转染实验表明，靶向病毒结构基因的单个crRNA,crGag2,crPol1,crA53能降低HIV-1子代病毒RNA表达降低了43.2%～58.3%，同样，再次感染实验也证明子代病毒活性滴度降低了38%～74.6%。进一步的结果证明，4个crRNA(crD15,crA53,crGag2,crPol1)联用比单个crRNA表达降低了86.4%，比两个crRNAs降低了64.9%，同时在共转染HEK293T细胞中观察到Cas13a蛋白的附属切割活性及其诱导细胞凋亡。我们建立的CRISPR/Cas13a系统能够显著抑制HIV病毒复制和子代病毒产生并诱导细胞凋亡，为HIV的治疗提供了一种新的工具。
2023年广东省急性出血性结膜炎流行末期病原组成及基因进化分析
杨银柯;钟干芳;徐俊贤;蓝天;林静佳;徐建华;张薇;曾汉日;李柏生;郑焕英;分析2023年广东省急性出血性结膜炎（Acute hemorrhagic conjunctivitis,AHC）疫情流行末期病原体组成及其分子特征情况，为AHC的防治提供科学依据。本研究采集AHC流行末期81份AHC患者眼结膜拭子，采用实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR,qPCR)方法，对其进行人肠道病毒70型（Human enterovirus 70,HEV70）、柯萨奇病毒A组24型变异株（Coxsackievirus A24 variant,CVA24v）和腺病毒（Adenovirus,AdV）核酸检测。通过HEp-2细胞进行病毒分离。对分离株进行PCR扩增和基因测序。用Mega11和BioEdit软件进行基因进化分析，用SWISS-MODEL进行VP1蛋白三维结构分析，通过IEDB进行VP1蛋白的B细胞抗原表位预测。结果显示81份眼拭子样本荧光定量PCR检测，EV70全部阴性，20份样本CVA24v阳性，16份样本AdV阳性。使用HEp-2细胞成功分离到8株CVA24v毒株。基于分子测序分析发现，2023年AHC流行末期的CVA24v病毒株与5月份疫情初期病毒株相比，8株CVA24v毒株在3C区核苷酸共有7处突变，其中在第309位点共享同义突变C→T。在VP1区共有19处突变，除AHC705/GD/CHN/2023株外，其余7株在第30位点共享同义突变T→C。此外还获得一株CVA24v的全基因组序列，和流行初期病毒株全长序列相比有24个核苷酸突变，3个氨基酸突变。本研究通过分析VP1蛋白的三维结构预测，识别出了本次疫情流行末期相比早期出现三个变异位点，其中T98A和A146T两个位点位于蛋白表面，参与组成抗原决定簇。研究结果显示，与疫情初期由CVA24v独立引起的流行相比，流行末期出现了CVA24v与AdV共同流行的现象。这一发现对理解病毒变异与流行动态具有重要意义。
H10N3禽流感病毒安徽分离株遗传多样性研究
李珊;董卉;姚雪;张春鸽;邢薇佳;李娟;史卫峰;2021年4月我国江苏确诊全球第一例人感染H10N3禽流感病例，研究我国活禽市场H10N3亚型禽流感病毒（Avian influenza virus, AIV）的遗传多样性和分子特征，将为理解人感染H10N3病毒的进化来源、评估其溢出风险提供理论依据。为此，2021年6-12月我们对安徽地区活禽市场销售家禽及环境中H10N3 AIV进行实时荧光定量RT-PCR检测，共分离鉴定到6株H10N3病毒（AH01-AH06），其中1株为11月份环境样本分离株，其余5株为6月、11月和12月鸡咽拭子分离株。高通量测序和生物信息学分析表明，同一活禽市场分离到的毒株表现出一定的遗传多样性和重配模式差异：4株H10N3分离株（AH01-AH04）间核苷酸同源性均高于99.00%，而A/chicken/Anhui/11-30-YHZGS024-O/2021(AH05)株的MP基因片段和A/chicken/Anhui/06-26-YHZGS006-O/2021(AH06)株的PA、MP基因片段与其他分离株的核苷酸同源性较低，均低于97.04%。系统发育分析显示，本研究6株H10N3分离株与人源H10N3病毒的HA和NA基因均位于欧亚进化分支，它们的内部基因都来自H9N2亚型AIV。特别是分离株AH06与人感染H10N3病毒八个基因均位于同一进化分支，而分离株AH01-AH05的PA基因与人感染H3N8和H9N2毒株、MP基因与人感染H9N2毒株的亲缘关系较近。分子遗传特征分析显示，6株H10N3 AIV的血凝素蛋白均携带G228S等哺乳动物适应性突变，提高了对人源受体的结合能力。综上，本研究证实了禽源H10N3病毒在安徽省活禽市场的持续流行，揭示了禽源H10N3病毒的遗传多样性以及新型感染人的H10N3在我国家禽中传播，强调其携带多个哺乳动物适应性突变，为评估H10N3 AIV潜在公共卫生风险提供了理论依据。
大口黑鲈弹状病毒qPCR检测方法的建立与临床应用
陈雪兰;蔺凌云;杨娜;王亿文;姚嘉赟;沈锦玉;潘晓艺;大口黑鲈弹状病毒病是引起大口黑鲈幼苗暴发性死亡最严重的疾病，为满足大口黑鲈幼苗弹状病毒（Micropterus salmoides rhabdovirus, MSRV）的快速检测，建立大口黑鲈弹状病毒SYBR Green qPCR检测方法。根据大口黑鲈弹状病毒核蛋白基因的保守序列设计qPCR引物，对反应体系进行优化，制作标准曲线，并进行灵敏度、重复性和特异性测试，建立染料法qPCR检测方法，并在临床标本和人工感染鱼组织样品中进行应用。结果表明，构建的标准曲线，模板量与Ct值之间具有良好的线性关系，相关系数R2为0.9994，检测灵敏度达到4.5拷贝/μL，除MSRV、鳜弹状病毒（Sinipercachuatsirhabdovirus,SCRV）、杂交鳢弹状病毒（Hybridsnakeheadrhabdovirus,HSHRV）和斑鳢弹状病毒（Channamaculatarhabdovirus,CMRV）外，对其他7种病毒大口黑鲈蛙虹彩病毒（Largemouth bass ranavirus, LMBV）、传染性脾肾坏死病毒（Infectious spleen and kidney necrosis virus, ISKNV）、神经坏死病毒（Nervous necrosis virus, NNV），传染性造血器官坏死病毒（Infectious hematopoietic necrosis virus,IHNV）、鲤春病毒血症病毒（Spring viraemia of carp virus, SVCV）、草鱼呼肠孤病毒（Grass carp reovirus, GCRV）和黄颡鱼小RNA病毒（Yellow catfish picornavirus, YCPrV）都无扩增荧光信号；在对45份临床样品的检测中，建立的qPCR检出阳性率比套式PCR高11.11%；对人工感染MSRV的不同规格（1 g/ind、3 g/ind、8 g/ind）大口黑鲈各组织检测结果显示，脾脏中病毒载量最高，并且大规格鱼苗（8 g/ind）组织中病毒载量要低于小规格鱼苗（1 g/ind、3 g/ind），表明小规格鱼苗更易感。以上结果表明，建立的大口黑鲈弹状病毒SYBR Green qPCR检测方法是一种适合临床样品检测的特异性强、灵敏度高、稳定性好的MSRV定量方法。该方法的建立为MSRV疾病检疫提供了可靠的技术手段。