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网络首发

逆转录病毒及其载体滴度优化的研究进展

杜丽萍;官艳东;温凤鲜;张杰;徐明明;

逆转录病毒及其载体的逆转录特性和遗传稳定性使其被广泛应用于各个领域。逆转录病毒(如小鼠白血病病毒)可作为指示病毒应用于生物制品生产工艺中的病毒清除、灭活验证领域。逆转录病毒载体通过基因传递技术靶向特定组织或细胞进行长期转基因表达,广泛应用于基因治疗、基因改造等领域。随着逆转录病毒及其载体的使用范围扩大,生产高滴度病毒或病毒载体的能力对于避免增加生产成本及减少下游纯化压力非常重要。如何优化病毒滴度是病毒清除、灭活验证或基因传递技术领域亟待解决的问题。本文综述了逆转录病毒及其载体滴度的优化进展和策略,总结了影响逆转录病毒滴度的潜在因素,以期为未来逆转录病毒滴度的优化提供参考。

年 期 ;
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靶向HIV-1的Cas13a/crRNA的快速筛选和抗病毒活力测定

王涛;夏学娇;马妍;高阳;周颖;董廷;涂茜;马文博;顾潮江;

目前基于规律成簇的间隔短回文重复(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)/CRISPR相关蛋白(Cas)系统的基因治疗在遗传病、肿瘤及感染性疾病等领域均取得重大突破,其中Cas13a属于VI型CRISPR系统,Cas13a蛋白在HIV感染细胞内crRNA的引导下定位目标RNA,切割核酸,同时激活Cas13a蛋白的附属效应(Collateral effect)可高效切割细胞内非特异性单链RNA,从而诱导感染细胞凋亡,进一步破坏病毒库,是最有可能功能性治愈HIV的策略。本研究旨在筛选靶向HIV-1的高灵敏度crRNA,进一步探索组合不同crRNA对HIV-1的抑制效果,并在细胞转染水平证明Cas13a/crRNA系统的附属切割活性及其诱导细胞凋亡。在LANL数据库中比对HIV-1各亚型毒株序列,获得各功能蛋白高度保守区。同时,结合HIV数据库中RNA的剪接供体及受体位点信息;然后利用MPRDOCK软件进行crRNA与LwCas13a的分子对接并计算结合复合物的自由能大小选定一组crRNA池;再以荧光标记RNA探针与LwCas13a蛋白组成可视化检测体系,以FAM荧光信号强弱确定了最有效的crRNA。构建LwCas13a和crRNA的共表达质粒,通过共转染HIV全长感染性克隆质粒和含单个或多个crRNA组合的LwCas13a的表达质粒到HEK293T细胞中,根据转染细胞及其上清再感染细胞中萤光素酶和病毒结构蛋白RNA表达水平来判定CRISPR-Cas13a系统对HIV基因表达的抑制效率。初步筛选出优选的27条crRNA并结合切割荧光强弱从中筛选出8条高灵敏度crRNA。细胞共转染实验表明,靶向病毒结构基因的单个crRNA,crGag2,crPol1,crA53能降低HIV-1子代病毒RNA表达降低了43.2%~58.3%,同样,再次感染实验也证明子代病毒活性滴度降低了38%~74.6%。进一步的结果证明,4个crRNA(crD15,crA53,crGag2,crPol1)联用比单个crRNA表达降低了86.4%,比两个crRNAs降低了64.9%,同时在共转染HEK293T细胞中观察到Cas13a蛋白的附属切割活性及其诱导细胞凋亡。我们建立的CRISPR/Cas13a系统能够显著抑制HIV病毒复制和子代病毒产生并诱导细胞凋亡,为HIV的治疗提供了一种新的工具。

年 期 ;
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柯萨奇病毒A10型对利巴韦林耐药性的初步研究

孙甜甜;宗彦君;王蕊;李冀琛;刘莹;李晓亮;韩振志;于力恒;刘志军;孙强;张勇;

近年来,全国范围内手足口病(Hand, foot, and mouth disease,HFMD)的感染率逐渐上升,其中柯萨奇病毒A组10型(Coxsackievirus A10,CV-A10)是主要病原体之一,利巴韦林是临床上治疗儿童手足口病的常用药物之一。为了评价利巴韦林在体外对CVA10的抑制效果,本研究中,我们随机选取了19条2009-2021年的不同地区和不同年代的有代表性的中国大陆优势流行基因型C基因型的CVA10毒株,通过细胞毒性实验(Cell counting kit-8,CCK8)来检测利巴韦林在RD细胞上对CVA10的抑制率。将抑制率大于85%的CVA10定义为对利巴韦林敏感组,抑制率小于15%的CVA10定义为对利巴韦林耐药组。结果显示利巴韦林在0.78mmol/L浓度下可以对CVA10产生较好的抑制作用并且对细胞的毒性较低。19株CVA10中有4株表现出对利巴韦林耐药性,2株表现出对利巴韦林敏感性,剩余13株的敏感性在85%~15%之间。通过7日龄ICR乳鼠感染实验比较对利巴韦林敏感组和耐药组毒株的致病力差异,通过观察乳鼠临床评分、生存率、体重及组织取材的滴度测定结果均表明对利巴韦林敏感组CVA10在小鼠上的致病力比耐药组强。进一步使用MEGA 7.0软件对影响CVA10复制和翻译的2C区氨基酸序列进行差异性分析,以分析可能的耐药位点。结果显示对利巴韦林耐药组和敏感组CVA10的2C区的327位和328位氨基酸位点存在差异。本研究发现当前国内流行的CVA10存在广泛对利巴韦林耐药现象,其中部分CVA10对利巴韦林完全耐药。因此,有必要加强对CVA10耐药株的监测,以便更好地指导临床医生正确地选择抗病毒药物,为个体化的治疗提供理论依据。

2024 年 02 期 ;
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人星状病毒流行病学研究进展

李函凝;傅佳美;高志勇;

人星状病毒(Human astrovirus, HAstV)属于星状病毒科,包含多种基因型,是引起急性胃肠炎散发病例的重要病原之一,偶尔也可在人员密集场所引起疫情的暴发。除消化系统以外,HAstV还可以在其他系统中被检出,其中中枢神经系统相关的研究最为广泛。目前HAstV的检测方法较前有所完善,已有多种分子检测技术和细胞模型被用于HAstV的研究和检测。本文就HAstV的病原学特征、常用检测方法、所致疾病、流行病学特征以及防控措施进行综述。

年 期 ;
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4例新型冠状病毒感染病例鼻拭子、咽拭子病毒核酸检测和血浆抗体检测结果分析

陈荣华;李勤光;赵敏;陈惠聪;康惠玲;柳丽娟;

新型冠状病毒(SARS-CoV-2)核酸检测和血浆抗体检测是目前确诊新型冠状病毒肺炎(COVID-19)的重要依据。为比较分析SARS-CoV-2感染病例鼻拭子与咽拭子的病毒核酸检测及其血浆病毒抗体检测结果,本研究采用实时荧光定量PCR方法,分别检测4例COVID-19确诊病例鼻拭子与咽拭子标本的SARS-CoV-2 ORF 1ab基因和N基因,并采用胶体金法检测血浆标本中的SARS-CoV-2 IgM和IgG抗体。结果显示,在4例COVID-19确诊病例中,鼻拭子中病毒ORF 1ab基因及N基因的核酸扩增信号均强于咽拭子,Ct值均低于咽拭子;血浆病毒抗体检测仅发现1例标本SARS-CoV-2 IgG单阳性。本研究结果提示,鼻拭子标本的病毒含量明显高于咽拭子标本,血浆病毒IgM和IgG抗体检测是COVID-19辅助临床诊断的有效工具。

年 期 ;
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