病毒学报

肠道病毒病的防控现状、核心难题及创新方向

2019-2024年北京地区儿童手足口病病原学监测及流行病学分析

肠道病毒D68型VP1-N90K突变增强其在乳鼠感染致病力研究

广东省EV-A71 B5基因型的分离鉴定、分子流行病学及抗原性研究

柯萨奇A组16型重组报告病毒的构建及快速中和实验的建立

云南省三带喙库蚊携带流行性乙型脑炎病毒全基因序列分析

目的 了解云南省玉溪市华宁县蚊虫携带流行性乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus, JEV）的流行状况及其基因组特征，为乙脑防控提供分子流行病学依据。方法 于2023年7月在华宁县采集蚊虫标本，根据蚊虫形态学特征进行分类鉴定。每30只蚊虫为一组，采用荧光定量PCR法检测JEV核酸。筛选Ct值≤30的2株JEV阳性样本开展二代tNGS全基因组测序，利用BioEdit、MegAlign、MEGA、ESPript、SOPMA和SWISS-MODEL等生物信息学软件进行系统发育树分析、同源性分析、氨基酸变异位点分析以及蛋白质二级和三级结构预测。结果 共采集蚊虫3属4种4 230只，其中三带喙库蚊为当地优势蚊种，占比84.40%(3570/4230)。分141组进行荧光定量PCR检测，JEV阳性率为4.96%(7/141)；成功对2株阳性标本完成全基因组测序，获得2条10965个核苷酸长序列，均编码3432个氨基酸。基于全基因组序列及E基因序列构建的系统发育树分析表明，华宁县病毒株与GⅠ型JEV参考株处于同一分支，核苷酸同源性为91.33%～95.80%，氨基酸同源性为96.75%～99.20%；与GⅡ～GⅤ型参考株核苷酸同源性为77.07%～87.80%，氨基酸同源性为89.69%～98.18%。氨基酸差异位点分析显示，华宁县病毒株与乙脑减毒活疫苗株SA14-14-2在E基因上共有21个氨基酸差异位点，其中8个位于与神经毒力相关的氨基酸位点，其余13个均位于关键抗原表位之外。E蛋白二级结构及三级结构预测结果显示，华宁县病毒株以无规则卷曲为主要结构特征。结论 2023年华宁县三带喙库蚊携带的JEV为GⅠ型，与减毒活疫苗株SA14-14-2在抗原性表位相关关键氨基酸位点上无明显变化。本研究为当地JEV的进化追踪及防控策略优化提供了科学依据。

表达小反刍兽疫田间毒株HN糖蛋白重组山羊痘毒株的构建及其增殖特性分析

目的 小反刍兽疫（Peste des petits ruminants, PPR）和山羊痘（Goat pox）是两种危害小反刍动物的高度接触性传染疫病，严重阻碍了我国养羊产业的健康发展。方法 为构建表达小反刍兽疫病毒（Peste des petits ruminants virus, PPRV）HN蛋白的山羊痘重组病毒载体二联疫苗，以先前构建的p UC19T-ΔTK-RFP载体，利用同源重组技术将PPRV HN基因克隆至p UC19T-ΔTK-RFP上构建p UC19T-ΔTK-PPRV-HN转移载体。将转移载体转染Vero细胞，通过与红色荧光山羊痘病毒（GTPV-ΔTK-RFP）重组进行病毒拯救。利用有限稀释法将拯救成功的重组病毒（GTPV-ΔTK-PPRV-HN）进行纯化。再通过蛋白免疫印迹、间接免疫荧光和测序验证GTPV-ΔTK-PPRVHN重组病毒的生物学及其增殖特性。结果 结果表明，本研究成功构建GTPV-ΔTK-PPRV-HN重组病毒并且该重组病毒能够表达PPRV HN蛋白，重组病毒生长特性良好。结论 本研究为PPRV和GTPV的二联疫苗提供理论基础和实践依据，将有利于保障养羊产业的健康发展，助力乡村振兴。

G6P[1]型牛轮状病毒BLL株感染性克隆的构建

轮状病毒（Rotavirus, RV）是全球婴幼儿重症腹泻的主要病原体，其疫苗保护效率在低收入国家亟待提高。探索和开发新一代高效轮状病毒疫苗对低收入国家易感人群的轮状病毒防治具有重要意义。本研究基于G6P[1]型牛轮状病毒BLL株体外高效复制特性及全基因组测序结果，利用同源重组等技术构建了包含BLL株11个基因片段的感染性克隆质粒，通过反向遗传学技术拯救该病毒株。采用dsRNA-PAGE硝酸银染色和RT-PCR扩增技术鉴定毒株，并进一步通过间接免疫荧光、qRT-PCR技术测定拯救毒株的病毒滴度及生长动力学。结果表明构建的G6P[1]型牛轮状病毒BLL株感染性克隆可以成功拯救，拯救病毒株的病毒滴度及复制能力均高于羊轮状病毒（Lanzhou lamb rotavirus, LLR）疫苗株，为进一步开展基于牛轮状病毒BLL株的疫苗研发及相关机制研究提供了技术手段和基础。

反向疫苗学在呼吸道合胞病毒疫苗研发中的应用

呼吸道合胞病毒（Respiratory syncytial virus, RSV）作为诱发免疫低下人群严重下呼吸道感染（Respiratory syncytial virus lower respiratory tract disease, RSV-LRTD）的主要病原体，其疫苗研发长期受困于抗原变异、免疫力不持久及缺乏理想动物模型等挑战。反向疫苗学（Reverse vaccinology, RV）通过整合基因组学、结构生物学和计算免疫学，实现了疫苗抗原的科学筛选与优化整合，显著推进了呼吸道合胞病毒疫苗从基础研究到临床应用的转化进程。本文系统综述了反向疫苗学在RSV疫苗领域的应用进展：早期锁定关键抗原F蛋白和G蛋白；中期解析并优化蛋白构象；近期预测并联合多表位设计得到广谱保护疫苗；未来，基于反向疫苗学的人工智能辅助抗原设计、通用多联疫苗开发及针对不同高危人群的免疫策略优化是RSV疫苗研发的重要方向。

以猴轮状病毒SA11株为骨架表达猪轮状病毒VP4/VP7基因重组病毒的构建及其免疫原性评价

本研究以猴轮状病毒rSA11株为骨架，利用反向遗传技术构建分别表达猪源VP4、VP7的三种重组病毒rSA11-NJ2012-VP4、rSA11-NJ2012-VP7及rSA11-NJ2012-VP4/6/7，测定重组毒株的体外生物学特性，分析其在小鼠体内的免疫原性。以猪轮状病毒NJ2012株（G9P[7]型）为模板，构建其VP4、VP6和VP7基因的感染性克隆质粒，分别替换SA11株的相应基因，利用完全基于质粒的反向遗传操作系统构建重组病毒。利用western blot、间接免疫荧光、dsRNA-PAGE、一步生长曲线、蚀斑实验及透射电镜等对拯救的重组病毒进行体外生物学特性鉴定，然后免疫小鼠并通过ELISA和中和试验等实验对其免疫原性进行评价。通过观察典型细胞病变、基因测序、dsRNAPAGE、免疫荧光等实验证实三种重组病毒拯救成功。一步生长曲线、噬斑实验及透射电镜验证了重组病毒与亲本毒株之间生物学特性存在一定差异。三种重组病毒免疫小鼠后能够有效刺激机体持续诱导高水平特异性IgG，诱导产生的中和抗体对同型毒株有较好的中和活性。本研究以rSA11株为骨架，利用完全基于质粒的反向遗传操作系统成功拯救分别表达猪源VP4/VP7基因重组病毒，并在小鼠模型中评估重组病毒的免疫原性，为快速开发新型猪轮状病毒候选疫苗奠定基础。

含P_RP_L启动子的原核高效表达载体的组建及其应用

我们组建了一个含P_RP_L自动子的原核高效表达载体,它同时含有cI调控基因、多酶切点和两个强的转录终止序列。带起始密码子ATG的外源基因可以插入启动子下游的多酶切点,表达非融合蛋白,产品可供临床使用。我们实验室已用它成功地表达了人γ干扰素、人白细胞介素-2和人肿瘤坏死因子等,表达量均占菌体总蛋白的20％以上。

鸡的J亚群白血病病毒的分离及部分序列比较

通过接种鸡胚成纤维细胞、聚合酶链式反应 (PCR)技术及特异性单抗的间接荧光抗体反应 (IFA) ,从某大型肉用型种鸡场的疑似J亚群白血病的病鸡中 ,以及 2 5个临床健康的商品代肉鸡群的 2群中 ,分离鉴定出J亚群禽白血病病毒 (ALV J)。在用抗ALV Jgp85单克隆抗体JE9的IFA中 ,来自病鸡群的两株病毒SD990 1和SD990 2呈强阳性反应 ,来自临床健康肉鸡群的YZ990 1和YZ990 2株呈弱阳性反应。对YZ990 1株和SD990 2株的PCR产物直接测序结果表明 ,这二个中国株的囊膜蛋白 gp85的氨基酸组成与原型株HPRS 10 3及美国分离株ADOL Hcl有 89%～ 93%的同源性 ,它们相互间的同源性是 92 %。其 3′端LTR区与原型株HPRS 10 3则有 95 %～ 97%的同源性 ,但中国的两株病毒在紧靠 3′端LTR的“E”成分中 ,出现了一个 139个碱基的缺失性突变 ,而代之以一个 11个碱基的插入序列。

在我国腹泻患儿中发现诺瓦克样病霉感染

诺瓦克病毒是引起无菌性急性胃肠炎爆发的重要病原。１９９０年１０月至１９９１年１月从河南省急性腹泻门诊患儿便样中发现了诺瓦克样病毒。经电镜观察，病毒直径约为２８ｎｍ，病毒壳似由有结构的亚单位组成，进一步用诺瓦克病毒特异的寡核苷酸引物做逆转录一聚合酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ），检定为阳性。由ＰＣＲ产物测得的核苷酸序列与诺瓦克病毒原型株相应序列比较，同源性为７２％。以上结果证实，在我国腹泻病人中有诺瓦克样病毒感染。这对我国病毒性胃肠炎流行的防治研究具有重要意义。

肠道病毒71型的RT-PCR诊断及基因特征

2002～2003年从上海市和重庆市手足口病患儿的疱液标本中分离到10株病毒,其中上海9株,重庆1株。利用两对分别针对EV71和Cox.A16病毒VP1区的特异性引物,用RT PCR方法对病毒进行初步鉴别。根据PCR所用引物及PCR扩增出的产物片段大小不同,可初步判定出EV71和Cox.A16病毒的血清型别。RT PCR结果提示,上海分离到的9株病毒中,有2株为EV71,其余7株病毒为Cox.A16;重庆分离到的1株病毒为EV71。10株病毒的RT PCR产物经序列测定和分析证实,PCR定型结果正确,说明PCR法具有很高的特异性,可作为EV71初步鉴定的首选方法。对所分离的3株EV71病毒进行VP1区编码基因全序列的测定和遗传学分析,通过同源性比较和构建系统发生树发现,此3株EV71病毒和中国大陆已发表的7株EV71病毒(SHZH03、SHZH98、SH F1、SH F2、SH H25、SH H26和CHN 87)全部属于C基因型,与该型代表株比较,同源性为89 3%～94 6%;与A、B基因型代表株比较,同源性为81 3%～84 0%,差异较大。在C基因型中,此3株EV71病毒和中国大陆先前分离的6株病毒(SHZH03、SHZH98、SH F1、SH F2、SH H25、SH H26)的同源性较高,在94 5%～100%范围内。在系统发生树上,这9株病毒形成一个较独立的分支。与CHN 87株的同源性在92 1%～93 6%之间。与已知的C1、C2、C3亚型代表株比较,同源

我国地方品种鸡分离到的一个禽白血病病毒新亚群的鉴定

为探明我国地方品种鸡群禽白血病病毒(Avian leukosis virus,ALV)的特点,通过接种DF-1细胞及细胞培养上清液p27抗原的检测,从芦花鸡中分离得到三株外源性ALV禽白血病病毒,分别是JS11C1、JS11C2和JS11C3,并对其进行亚群鉴定分析。用PCR方法扩增env基因测序,并与已知鸡源各亚群ALV的囊膜蛋白(gp85)作氨基酸同源性比较。这三株ALV的env基因的gp85大小为1 005bp,编码335个氨基酸;env基因的gp37大小为609bp,编码203个氨基酸。三个毒株之间gp85的同源性为91.9%～97.0%。与A、B、C、D和E五个经典亚群在GenBank中已发表的18个毒株的gp85的同源性仅在77.7%～84.6%间,显著低于鸡群中常见的A、B、E各亚群内的同源性范围(分别为88.2%～98.5%,91.6%～98.8%和97.9%～99.4%),而与J亚群参考株的同源性更是只有34.2%～36.5%。上述结果表明,芦花鸡分离到的三株病毒可能是不同于鸡源ALV已知6个亚群的一个新亚群,按国际上对ALV亚群分类的习惯,初步将其定名为K亚群。

新冠病毒SARS-CoV-2的感染机制研究进展

由新型冠状病毒(SARS-CoV-2)引起的冠状病毒病2019(COVID-19)作为一种新发传染病,已经蔓延到全世界的多个国家和地区,被WHO判定为全球大流行病(Pandemic disease),引发了严重的公共卫生安全问题。自SARS-CoV-2出现以来,病毒溯源和中间宿主等问题得到了民众的广泛关注,虽然只有约2%的感染者有野生动物接触史,但科学家普遍认为SARS-CoV-2是一种来自野生动物的病毒。病毒的跨种属传播十分困难,而且往往会引起新宿主的高病死率,但SARS-CoV-2被发现以来,表现出对人类机体已经有了很好的适应性,具有传播能力强和病死率较低的特性,这与之前发现的引起新发、突发传染病的大多数病毒有所不同。因此,本文对SARS-CoV-2的病原学,功能受体和基因组进化等方面的研究进展进行综述,以期为SARS-CoV-2的溯源提供新的视角。

新型冠状病毒肺炎的疫情趋势预测

2019年12月以来,湖北省武汉市部分医院陆续发现了多例不明原因肺炎病例,现已证实为新型冠状病毒肺炎(Coronavirus disease 2019,COVID-19)。全国各地采取了前所未有的措施,大力开展疾病救治和防疫工作。本文收集中国国家卫生健康委员会公布的官方统计数据预测疫情走向。传统SEIR模型中仅考虑病例和处于潜伏期的感染者,病例具有传染性而潜伏者无传染性;事实上,新冠肺炎确诊患者在医院中隔离无法对外界易感人群造成感染,有研究表明处于潜伏期的感染者可能具有传染性。因此,本研究提出了改进的传染病传播模型—ISEIR,将患者分为未收治的发病患者(具有传染性)和已收治的确诊患者(不考虑传染性),并考虑处于潜伏期的感染者具有传染性;以历史数据动态拟合模型参数,来摆脱固定参数的局限性。在数据预处理中根据每日有效再生数的概率分布将2020年2月12至14日这三天的临床诊断数据进行预处理,摊入到前期数据中。疫情分成全国(湖北省外)和湖北省两大区域分别进行探讨,通过新模型ISEIR预测今后疫情的进一步发展,并计算每日的有效再生数变化。结果显示,湖北省的有效再生数从3.108逐渐降低,2020年4月19日所有患者将全部治愈出院,累计确诊患者为66 487人;全国(湖北省外)的初始有效再生数为1.929,小于湖北省,2020年3月26日所有患者全部治愈,累计确诊患者13 270人。从结果中可以发现,在严格的防控措施下疫情得到了有效抑制,验证了目前防控措施的有效性,但仍需要防止复工潮引起的疫情反弹。

新型冠状病毒（2019-nCoV）治疗药物体内外研究及药物研发进展

2019年12月以来,中国湖北省武汉市陆续发现了多例新型冠状病毒感染的肺炎患者,随着疫情的蔓延,中国其他地区及境外也相继发现了此类病例。2020年1月12日,世界卫生组织(WHO)将该新病毒暂定命名为2019新型冠状病毒(2019-nCoV)。2019-nCoV是继SARS冠状病毒(SARS-CoV)、MERS冠状病毒(MERS-CoV)之后发现的一种具有高传染性且可以引起重症呼吸道疾病的新型病毒,临床尚无特效治疗药物。本文结合临床治疗、体内外的研究对相关指南推荐的治疗药物及药物研发进展进行综述,旨在为2019-nCoV病毒感染的肺炎患者的临床治疗提供借鉴。

2019新型冠状病毒的研究进展

自2019年12月以来,新型冠状病毒SARS-CoV-2引发的肺炎疫情在中国武汉暴发,随后疫情迅速蔓延,扩散至中国其它各省市。新型冠状病毒属于β冠状病毒属,与SARS-CoV和MERS-CoV近缘但有较大区别,尤其是刺突蛋白(Spike,S),根据序列相似性推断可能来源于蝙蝠,使用与SARS-CoV相同的血管紧张素转化酶Ⅱ(Angiotensin-converting enzyme Ⅱ,ACE2)受体进入细胞,以飞沫和接触传播为主要传播途径,缺乏有效药物治疗和疫苗是疫情防控的挑战。

埃博拉病毒侵染细胞机制的研究进展

埃博拉病毒能在人类和非人灵长类中引起严重的埃博拉出血热,病死率可高达90%,并且目前还没有针对埃博拉病毒有效的疫苗或者是治疗手段。面对埃博拉病毒带来的挑战,针对埃博拉病毒的相关研究已经成为病毒学的热点问题。其中,关于埃博拉病毒侵染细胞机制的科学研究对于开发病毒疫苗以及新型治疗药物有非常关键的作用。因此,本综述拟就埃博拉病毒侵染细胞机制方面的研究进展进行总结。